研究背景颞下颌关节(temporomandibular joint,TMJ)髁突“软骨退变”是众多TMJ疾病的共有病理特征,可导致软骨下骨破坏吸收,引起TMJ疼痛、张口受限等关节症状。由于软骨为无血管的组织,一旦发生损伤或破坏,其修复极为困难。通过干细胞向软骨细胞定向分化进而修复损伤的软骨细胞已成为当前研究的重点。目前常用的种子细胞主要包括以下几种:骨髓基质干细胞(bone marrow stroma stem cells,BMSCs)、胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)等。尽管BMSCs向软骨分化的技术已经较为成熟,但由于其来源于中胚层的细胞特性及有限的增殖能力和多向分化等不可控因素,限制了BMSCs在修复关节软骨尤其是TMJ关节软骨方面的应用。而ESCs向关节软骨分化虽已得到越来越多学者的认可,但这些技术绝大多数通过中胚层诱导而来,与TMJ的发育过程并不相符。其原因在于,在胚胎发育过程中,TMJ起源于神经外胚层而非中胚层。研究目的本研究拟模拟TMJ髁突软骨发育过程,诱导ESCs经神经外胚层分化成软骨干细胞,并从体内、外检测软骨干细胞的自我更新特性及分化潜能,进一步在动物层面研究诱导获得的干细胞在修复受损软骨组织中的作用。材料与方法第一部分:探索ESCs经神经外胚层分化成软骨干细胞的分化方法,观察细胞形态变化;采用PCR检测ESCs、软骨干细胞主要标志物;并检测诱导过程全能干细胞及三胚层关键标志物的表达情况,以明确细胞是否经外胚层分化而来。第二部分:分析诱导后细胞的干细胞特性,检测诱导后干细胞克隆形成能力,PCR检测不同代次诱导细胞标志物的变化情况,免疫荧光检测软骨干细胞主要标志物,流式细胞技术检测常见干细胞标志物的表达情况。对诱导细胞、患者髁突软骨及常用软骨细胞系进行深度测序并分析表达谱的差异。第三部分:对获得的软骨干细胞进行体外成骨、成软骨和成脂定向诱导分化;通过不同自发分化条件观察软骨干细胞成软骨分化效果;通过体内实验将软骨干细胞移植到免疫缺陷鼠皮下,以进一步明确软骨干细胞的特点及分化能力。第四部分:建立大鼠膝关节软骨损伤模型,将软骨干细胞移植到缺损关节处,通过HE染色、免疫荧光染色和软骨特异性染色等实验评价软骨干细胞修复软骨损伤的作用。结果第一部分:本部分研究发现,细胞形态从诱导前集落样生长的胚胎干细胞转变成诱导后间皮样单层生长的细胞。PCR结果显示多能干细胞标志物OCT4、SOX2和NANOG在诱导过程中逐渐减弱至消失。PCR及测序结果分析显示,诱导得到的细胞主要表达外胚层标志物(NESTIN、ALCAM、ANPEP),而中胚层和内胚层标志物几乎无表达。此外,软骨/骨相关标志物RUNX2、AGG、OCN和SOX9在诱导后的细胞内表达显著升高。第二部分:免疫荧光染色可见,诱导后的细胞干细胞相关标志物NESTIN和CD29呈阳性,软骨细胞相关标志物SOX9、RUNX2、SOX5和TWIST1免疫荧光染色呈阳性。流式细胞技术结果显示,诱导后的细胞不表达CD146,CD24,CD45,CD34和CD90,而CD29、CD73,CD71,CD105和CD44在大部分细胞中均有表达。克隆形成实验发现,诱导后的单细胞呈克隆样生长,且表达SOX9、Col1a1、SOX5、OCN、RUNX2和Col2a1,在不同代次诱导细胞间,上述RNA的表达量均未出现明显改变。免疫荧光共染显示,大部分诱导细胞增殖细胞核抗原(Ki67)和RUNX2呈现双阳性。转录组主成份分析表明,与常用软骨细胞系SW1353相比,诱导中期细胞和P9代次干细胞同人髁突软骨更接近。第三部分:HE染色显示,诱导获得的干细胞成软骨定向分化后,细胞呈嗜碱性染色,并可见软骨陷窝;免疫组织化学染色可见,AGG、RUNX2和Col2a呈阳性。成骨定向诱导分化后,茜素红染色显示大片成簇的强阳性;成脂分化后,胞浆中大量脂滴聚集。与人牙髓干细胞定向诱导分化结果类似。诱导得到的干细胞贴壁培养、置于胶原包被的凝胶海绵支架材料上培养和悬浮培养后,均可见细胞呈均匀的嗜碱性染色。同时甲苯安蓝、阿利新兰、番红O、COLⅡ、COLⅠ及COLⅩ也呈阳性表达。体内分化结果显示,移植后4周、8周、10周均可以看到实验组支架材料中有散在的集落样生长的嗜碱性软骨样结构。番红O染色可见,实验组凝胶海绵内可见集落样生长的软骨样结构呈鲜红阳性染色。凝胶海绵内的软骨结构AGG、ColⅡ和Lubricin呈强阳性,而OCN呈弱阳性。第四部分:在植入后8周,获取大鼠膝关节组织,行HE染色后可见,对照侧缺损部位未见明显的骨、软骨结构,只有大量炎症细胞浸润,而实验侧缺损处见类似于TMJ髁突软骨组织样结构,番红O染色呈橘色,且Col1a和Col2a呈双阳性。形成的软骨组织GFP免疫荧光染色呈阳性,说明植入的软骨干细胞实现了向软骨定向分化,修复并整合到损伤的软骨中。结论本研究证实,从ESCs经外胚层途径诱导分化得到一种具有自我更新能力的软骨干细胞,该干细胞有别于以往常见的中胚层干细胞,且具有成软骨、成骨和成脂分化潜能,并可自发成软骨分化,修复受损关节软骨。其意义在于:理论层面,本研究首次发现可通过定向诱导的方法将ESCs经外胚层分化为更接近髁突软骨的细胞;基础层面,为髁突软骨的基础研究提供了一种更合适的和更有前景的工具细胞;临床层面,本研究对诱导分化过程的探索有助于将来通过IPS技术实现髁突软骨的原位修复。