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甘蓝型油菜隐性核不育(RGMS)材料,由于其具有败育彻底、不育性表现稳定、细胞质来源丰富及恢复源广等优点,已成为利用油菜杂种优势的重要途径之一。目前,在生产运用中主要有双隐性核不材料S45AB和三隐性核不育材料7365ABC。由于7365A可以利用7365C来获得全不育群体,避免了拔除其50%可育株的问题,因而在生产运用上具有更大的运用前景。本研究所选择的材料是近等基因系7365AB,A和B材料的差异仅在BnMs3位点上,该基因的突变影响了7365A的育性。我们利用细胞学结合分子生物学的方法,阐述了7365A隐性核不育的的分子机理,首次提出了BnMs3在油菜花药发育中的功能角色。同时,还利用拟南芥T-DNA突变体的资源,分析了部分差异表达基因的功能。研究的主要结果如下：1.甘蓝型油菜7365A隐性核不育分子机理研究利用半薄切片技术比较了不育材料7365A和可育材料7365B在花药发育细胞学水平上的差异,发现在减数分裂前期两者花药发育没有明显的差异；但进入减数分裂后期,不育材料的绒毡层细胞一直不停地增大和液泡化,且不能向分泌型转化。随后小孢子的释放受阻,导致大部分的小孢子不能从四分体中释放,而少数释放的小孢子也不能形成正常花粉外壁,使得花粉的败育更加彻底。随后的胼胝质壁检测实验发现小孢子不能正常分离的原因是由于四分体周围的胼胝质不能被及时地降解。利用SSH技术构建了富含在可育材料中上调表达基因的文库,结合反向Northern blot筛选,获得了76个差异表达的unigenes o我们从中随机选取了7个unigenes来通过Northern blot验证其有效性。同时我们发现根据其不同的表达模式,这7个差异表达的基因可以被分为两类。第一类在不育材料中不表达或在其相应的时期表达较弱,；第二类基因在两种材料的花蕾中都表达,但与正常材料中相比,其在花药发育早期不育材料中的表达被延迟或抑制。利用拟南芥基因的功能注释信息,我们初步注释了所获的76个差异表达基因。unigenes结果其中8个不能利用拟南芥的信息注释,另外68个则可以通过拟南芥的基因信息来进行注释。进一步将这68个unigenes的功能进行分类发现,它们可以被分为8大类型。第一类的基因主要编码一些与代谢相关的酶类；第二类包括1个ABC转运蛋白和8个脂转运蛋白,这类基因参与到脂肪酸的转运过程。与拟南芥花药发育的spl/nzz, emsl和msl突变体芯片数据相比,发现了一些共同下调表达的基因。此外,还发现这些差异表达的基因参与了绒毡层发育、小孢子分离和花粉外壁的形成过程。由于拟南芥和油菜同属于十字花科,它们的读码框序列和基因功能具有高度的一致性。利用拟南芥花药发育调控网络中的基因信息,结合real-time PCR技术,我们发现,参与绒毡层向分泌型转化过程中的基因TDF1,AMS和MYB103在7365A中的起始表达量受到了明显抑制。此外,5个与绒毡层降解相关的半胱氨酸蛋白酶基因的表达在突变体中也受到相应的影响。小孢子的分离涉及到胼胝质的降解和随后的花粉母初生细胞壁的降解。A6和MSR66都编码β-1,3-葡聚糖苷酶,可能参与到胼胝质的降解过程,它们的表达量在7365A中也受到了抑制；QRT1,QRT2和QRT3参与到了初生花粉母细胞壁的降解过程,real-time PCR检测结果表明QRT1和QRT3在7365A突变体中减数分裂后期的表达量受到抑制。随后,与花粉外壁发育相关的基因NEF1,FLP1,CYP703A2,ACOS5, BnCYP704B1, BnCHSl(At4g00040),CHS2(At4g34850)和MS2,被用于real-time PCR分析,结果发现这些参与到孢粉素前体物质合成的基因,在7365A中的表达都受到了相应的影响。此外还发现,可能与孢粉素前体物质跨绒毡层质膜运输有关的MSR02(属于ABC转运蛋白家族)基因及可能与其长距离运输有关的脂类转运蛋白(LTPs)的表达在突变体中也都相应地下调。基于半薄切片、差异基因分离和real-time PCR的结果,我们首次提出了BnMs3在油菜花药发育中的作用模式。2.育性相关基因的功能分析为了进一步获得差异表达基因的功能,我们分析了3个unigenes (BnMSR02, BnMSR42和BnMSR53)对应拟南芥同源基因的T-DNA插入突变体的表型,发现只有MSR02是花粉发育所必需的。MSR02编码一个ABC转运蛋白,该类蛋白与脂类物质的运输有关。绒毡层合成的脂类物质具有两个去向,即向花药表皮(合成花药表皮角质)和向花粉外壁(合成孢粉素前体)。随后的扫描电镜和透射电镜的结果表明,msrO2突变体的花粉外壁发育异常,而花药角质层的发育却并没有受到影响。这一结果暗示了MSR02可能仅参与了绒毡层合成的脂类物质向花粉外壁方向的跨膜转运,而没有参与脂类物质向花药表皮的跨膜转运。RT-PCR、启动子分析结合mRNA原位杂交的实验表明,MSR02仅在油菜花药的绒毡层细胞中特异表达。