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猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus-associated disease,PCVAD)的免疫预防具有重要的经济价值。我国国产PCV2疫苗均系PK15细胞增殖PCV2病毒、配用油佐剂制备而成,临床免疫副反应大。一般认为,免疫副反应多是因抗原不纯引起的,另外,游离状态的PCV2病毒DNA可能引发免疫抑制。因此,研究PCV2抗原的浓缩纯化技术,提升国产疫苗质量,具有重要意义与实际应用价值。GEM表面展示系统是国外近年发展起来的一种抗原制备新技术。该技术包括GEM 颗粒(Gram-positive bacterial enhancer matrix particles)和蛋白锚钩(Protein anchor,PA)两个构件。GEM颗粒是乳酸乳球菌MG1363经热酸煮沸处理,去除其全部蛋白和核酸等物质后获得的球形细胞壁肽聚糖骨架。蛋白锚钩PA是N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的一个结构域,可以非共价方式与GEM颗粒结合。大量研究表明,与PA融合表达的目标蛋白可以展示在GEM颗粒表面。因此,设计并表达PA与病毒特异性纳米抗体的融合蛋白,GEM技术便可拓展应用于病毒抗原的浓缩纯化。本研究成功建立了细胞培养PCV2病毒和PCV2重组Cap蛋白VLP(virus-like particles)的GEM纯化方法。用纯化的抗原制备试验疫苗,初步评价其免疫保护效力,为研制高效PCV2疫苗奠定了良好的基础。本文主要研究内容如下:1.GEM-PCV2纯化系统基础构件的制备GEM颗粒制备:乳酸乳球菌MG1363用GM17培养基30℃恒温摇床振荡过夜,离心收集菌体,0.1MHCl重悬,水浴煮沸30 min,离心洗涤3次,-80℃保存备用。透射电镜观察结果表明,获得的GEM颗粒保持原菌的形态大小,表面光滑,核酸和蛋白已被完全去除。接头融合蛋白制备:该蛋白N端为PCV2特异性纳米抗体,C端为蛋白锚钩。将本实验室保存的重组质粒pZQ-Cap-PA与重组质粒pZQ-Nb双酶切后连接,获得重组锚钩-纳米抗体原核表达质粒pZQ-PA-Nb,转化BL21感受态细胞进行诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示,接头融合蛋白以不可溶的包涵体形式表达,分子量39 kDa与理论值相符,复性接头蛋白大部分存在上清中。GEM颗粒-接头蛋白复合物制备:200μL接头蛋白重悬lUGEM颗粒,室温作用30min,离心收集沉淀。透射电镜观察表明,GEM颗粒与接头蛋白结合后,其表面出现大量细小絮状物。2.PCV2病毒-GEM纯化方法的建立将GEM颗粒-接头蛋白复合物与细胞增殖PCV2病毒(NJ株)混匀,37 ℃孵育1 h,6000 rpm离心5 min,分别收集上清与沉淀。SDS-PAGE电泳、电镜观察、Western blotting、间接免疫荧光和PCR检测结果表明,GEM颗粒-接头蛋白复合物可特异性、高效地将PCV2病毒固定在其表面,离心后上清中无病毒残留。绝大部分细胞培养基及其它杂质在离心后被去除,沉淀中仅存在PCV2病毒、接头融合蛋白和GEM颗粒,以及少量杂蛋白。结合后的沉淀GEM-PCV2与原PCV2病毒同样具有良好的反应原性,表明本试验成功建立PCV2病毒的GEM纯化方法。3.GEM-PCV2疫苗免疫保护效力研究用GEM-PCV2纯化抗原制备试验疫苗,进行本动物免疫学试验。2周龄PCV2双阴性仔猪30头,分为GEM-PCV2单剂量组、GEM-PCV2五倍剂量组及四个对照组。免后21天ELISA方法检测血清PCV2特异性抗体水平,用PCV2 NJ株(10550 TCID50/mL)滴鼻攻击,攻毒后连续观察25天,其后称重,扑杀、剖检。试验结果表明,GEM-PCV2五倍剂量组PCV2特异性抗体阳性合格率为3/5,GEM-PCV2单剂量组血清抗体合格率为1/5,其它组PCV2特异性抗体均不合格。攻毒后25天,GEM-PCV2五倍剂量组仔猪体温与精神正常,PCV2特异性抗体平急剧上升,勃林格疫苗对照组PCV2特异性抗体水平不升反降。GEM-PCV2五倍剂量组平均相对日增重比勃林格疫苗组稍低,肺脏肉眼观察未见病变,PCR检测结果为阴性。由此推测,GEM-PCV2疫苗具有进一步深入研究的价值。4.PCV2-VLP-GEM纯化方法的建立PCV2-VLP制备:利用大肠杆菌表达系统CVC1102表达重组菌株pQZ-Cap,重组Cap蛋白表达量高,大部分以可溶性形式存在,Western-blotting鉴定该蛋白具有良好的反应原性,透射电镜观察,重组Cap蛋白体外组装形成VLP能力强。纯化方法建立:GEM-Pb与PCV2-VLP混匀,37 ℃孵育1 h,6000 rpm离心5 min,收集沉淀获得纯化的抗原。SDS-PAGE、Western Blotting检测结果表明,GEM颗粒-接头蛋白复合物可特异性、高效地结合Cap-VLP,单次离心就可去除绝大部分杂蛋白;间接免疫荧光实验证实,PCV2-VLP-GEM呈现为清晰的亮斑。该抗原浓缩纯化技术为研发新一代PCV2基因工程疫苗奠定了基础。