研究背景和目的端粒存在于真核生物线性染色体末端,其主要生物学功能是保护染色体末端,避免染色体末端被核酸酶降解,并有效防止染色体之间融合、重组和降解,在维持基因组的结构完整性和稳定性上起到重要作用。在正常人体细胞中,端粒可随着细胞分裂而逐渐缩短,随着分裂次数增加,分裂多次的细胞染色体端粒越来越短。当缩短到一定程度时,染色体DNA将变得不再稳定,细胞进入增殖衰竭期,螺旋解开,细胞继续存活但不能再分裂,最终走向自然衰老或死亡。人端粒酶是由人端粒酶RNA组分(hTR),人端粒酶相关蛋白和人端粒酶逆转录酶(hTERT)三部分组成的蛋白质复合物。它能在缺少DNA模板的情况下,以自身RNA为模板通过逆转录不断合成新的端粒重复序列,并连接到染色体端粒3,末端,弥补端粒丢失,从而阻止端粒的缩短,并可能使得细胞最终逃脱程序性死亡,获得无限增殖能力,即细胞永生化。在大部分的肿瘤组织中均检测到端粒酶活性,端粒酶活性与恶性肿瘤有着密切关系。这表明端粒酶的激活可能是肿瘤发生过程中的关键因素。90%以上的恶性肿瘤细胞因为激活端粒酶,能把端粒缩短的部分补上,细胞分裂后端粒并不缩短,这是肿瘤细胞永生化的重要前提条件,也使得端粒酶成为识别肿瘤细胞和正常细胞的6个重要标志之一。进一步的研究表明.端粒酶的表达水平与恶性肿瘤的发生、发展、转移及预后有着高度相关性。人端粒酶逆转录酶(hTERT)作为人端粒酶的重要组成部分之一。hTERTmRNA与端粒酶活性相一致,所以hTERT是控制细胞端粒酶活性的限制酶之一,对维持肿瘤细胞的生长非常重要,抑制端粒酶活性可以使细胞内的端粒正常地缩短长度。hTERT对端粒的延伸作用,乃至肿瘤的发生过程,不仅仅是简单地激活端粒酶,而且还包括hTERT蛋白在胞浆和核仁之间的穿梭运输机制。研究中证实hTERT C-端第965-981氨基序列所编码的蛋白是介导hTERT核仁定位的一个必须的核仁定位信号。进一步研究中发现,第965-981氨基酸序列中富含保守的碱性氨基酸,该区域是决定hTERT核仁定位的关键信号。hTERT通过相关蛋白的作用与端粒DNA3’悬突端结合,使端粒引物末端刚好位于端粒酶RNA(TR)模板区的起始端,是使端粒不断延伸的关键步骤。hTERT与端粒的结合部位主要是端粒DNA3’悬突端重复的(TTAGGG)n基因序列。有研究显示hTERT C-端中的第963-972氨基酸序列、第993-1002氨基酸序列、第1047-1056氨基酸序列、第1077-1086氨基酸序列和第1108-1117氨基酸序列所编码的五个蛋白与端粒DNA3’悬突端重复序列存在蛋白结合活性,能够与(TTAGGG)n重复序列形成蛋白质-DNA结合物。本文拟在hTERT C-端截取编码第936-1132氨基酸的碱基序列,并命名为hTERT C197,该基因序列包括核仁定位信号(第965-981氨基酸)和与端粒DNA3’悬突端结合的氨基酸序列(第963-972、993-1002、1047-1056、1077-1086、1108-1117氨基酸)。将hTERT C197通过构建原核重组质粒和真核重组质粒,并分别在原核表达系统和真核表达系统表达该片段蛋白,为了探讨hTERT在人类细胞内的定位与结合的情况提供前期的研究基础。为了初步研究hTERT C197对人类癌细胞和永生化细胞的作用,将构建的真核重组质粒分别转染人子宫癌Hela细胞和永生化的人胚肾293T细胞,采用MTT比色法检测细胞增殖和细胞活力。方法和内容：1. hTERT C197原核重组质粒构建与表达1.1外源基因片段的获取通过引物设计软件和原核表达载体多克隆位点区的特点设计PCR扩增引物,引物两端分别引入特异性酶切位点BamHI和XhoI,以hTERT cDNA为模板扩增外源基因序列,并经过回收纯化得到外源基因片段。1.2重组质粒的构建原核表达载体pEGX-4T-1和外源基因片段通过特异性内切酶BamHI和XhoI双酶切,将得到的酶切产物通过T4连接酶系统进行连接反应,所得连接产物转化入大肠杆菌DH5α,构建转化菌。提取原核重组质粒pEGX-4T-1-hTERT C197,并进行一系列鉴定,确定原核重组质粒的成功构建。1.3目的蛋白的诱导表达将成功构建的原核重组质粒转化入宿主菌BL21(DE3),并进行一系列鉴定确定工程菌的成功构建。采用IPTG诱导工程菌表达目的蛋白,提取细菌蛋白后,通过蛋白电泳和免疫印迹法检测和鉴定目的蛋白表达情况。2. hTERT C197真核组质粒构建与表达2.1外源基因片段的获取通过引物设计软件和原核表达载体多克隆位点区的特点设计PCR扩增引物,引物两端分别引入特异性酶切位点KpnI和Xbal,以hTERT cDNA为模板扩增外源基因序列,并经过回收纯化得到外源基因片段。2.2重组质粒的构建真核表达载体pcDNA3.1-HisA和外源基因片段通过特异性内切酶KpnI和XbaI双酶切,将得到的酶切产物通过T4连接酶系统进行连接反应,所得连接产物转化入大肠杆菌DH5α,构建转化菌。提取真核重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT C197,并进行一系列鉴定确定真核重组质粒的成功构建。2.3细胞转染与蛋白表达采用脂质体转染法将真核重组质粒转染入人子宫癌Hela细胞和人胚肾293T细胞,转染后48小时提取各自细胞的细胞核蛋白。通过免疫印迹法鉴定目的蛋白的表达情况。3. hTERT C197对Hela和293T细胞的细胞增殖及细胞活力的影响3.1细胞培养与转染按常规细胞培养方法对Hela细胞和293T细胞进行复苏、传代等操作。选择96孔培养板接种细胞,将Hela细胞和293T细胞分别按1×104个/孔和1.1×104个/孔的细胞量各转接于培养板。Hela细胞和293T细胞各转接7块96孔板,每块培养板中铺45个孔,待细胞贴壁后进行实验干预。3.2细胞增殖及细胞活性影响的统计学比较。实验干预后每隔24h取出Hela细胞和293T细胞各一块培养板,MTT法测量所有实验孔OD值,空白组、空载体组和重组质粒组各有3×5=15个单独样本。采用SPSS13.0统计软件,使用析因分析法和单因素方差分析法进行统计分析,分析是否具有显著性差异。依照公式：抑制率(%)=(1-重组质粒组OD值／空载体组OD值)×100%,计算每天的抑制率,从而得出hTERT C197对Hela和293T细胞的细胞增殖及细胞活力的影响。结果：1.外源基因片段可以通过PCR的方法扩增。2. hTERT C197可以与原核载体pEGX-4T-1构建原核重组质粒。3.原核重组质粒pEGX-4T-1-hTERT C197可以在宿主菌BL21中通过IPTG诱导融合蛋白表达,并通过免疫印迹法证明其表达。4. hTERT C197可以与真核载体pcDNA3.1-HisA构建真核重组质粒。5.真核重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT C197可以通过脂质体转染Hela细胞和293T细胞,并通过免疫印迹法证明,该蛋白能在细胞核内被检测。6.依照单因素方差分析结果显示,在实验干预后七天内,每天的空白组与空载体均无显著性差异(P>0.05)；每天的空白组与重组质粒组均有显著性差异(P<0.001)；每天的空载体组与重组质粒组均有显著性差异(P<0.001)。即转染载体pcDNA3.1-HisA对Hela细胞和293T细胞的增殖和活力无影响,而转染重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT C197对Hela细胞和293T细胞的增殖和活力有影响。7.通过统计学分析证明hTERT C197可以抑制Hela细胞和293T细胞的细胞增殖及细胞力性。hTERT C197对Hela细胞最大抑制出现在第五天,抑制率为33.07±0.229(%);hTERTC197对293T细胞最大抑制出现在第五天,抑制率为33.92±0.114(%)。结论1.成功构建原核重组质粒pEGX-4T-1-hTERT C197,并成功在原核表达系统中表达融合蛋白。2.成功构建真核重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT C197,并成功在真核表达系统中表达融合蛋白。3. hTERT C197对Hela细胞和293T细胞的细胞增殖及细胞活力具有显著性的抑制作用。本实验的创新之处：目前国际上对于恶性肿瘤发生机制已有多方面的研究。本课题首次构建包含hTERT936-1132编码序列(即hTERT C197)的原核重组质粒和真核重组质粒,并成功通过原核表达系统和真核表达系统表达蛋白。为下一步研究hTERT C端在肿瘤组织细胞内定位与结合提供了关键的实验材料。通过进一步的研究证实hTERTC197对Hela细胞和293T细胞的细胞增殖及细胞活力具有抑制作用,为抗肿瘤药物的研制提供新的思路。