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目的:探索miR-34c在鼻咽癌放射抗拒过程中所起到的作用,并利用体外细胞实验探究其对鼻咽癌的恶性行为及其放射抗拒的抑制作用。探寻miR-34c抑制鼻咽癌恶性行为及放射抗拒的下游靶点,并在体内验证miR-34c对鼻咽癌的抑制作用及其对下游靶点的调控。通过体内外实验,探究MSC转染miR-34c后,其外泌体是否与miR-34c一致,对鼻咽癌的侵袭迁移、增殖、凋亡以及放射敏感性有调控作用。意义:探寻影响鼻咽癌发生发展以及放射敏感性的关键分子,为后续探索其机理提供指导。探究了抑癌关键分子miR-34c在抑制鼻咽癌恶性行为及放射抗拒中的具体机制。证实了MSC外泌体可作为治疗性分子miR-34c的载体抑制鼻咽癌的恶性行为,提供了新颖的鼻咽癌治疗思路。方法:1.利用micro RNA测序技术对永生化鼻咽部上皮细胞系NP-69、鼻咽癌细胞系CNE-2、放射抗拒鼻咽癌细胞系CNE-2R中micro RNA表达进行高通量测序;利用生物信息学技术分析探究miR-34c在正常鼻咽部组织和鼻咽癌组织中表达量的差异,及miR-34c与鼻咽癌病人生存期的关系;将各个鼻咽癌细胞系分为空白对照组（blank组）、miR-34c空载组（miR-ctrl组）、miR-34c上调组（miR-34c-m组）、miR-34c下调组（miR-34c-i组）,利用transwell实验、集落形成实验和CCK8细胞增殖实验评价各组侵袭迁移能力及增殖水平;通过Western blot的方法验证上述各组中侵袭迁移及上皮-间质转化（EMT）关键分子表达量的改变;利用流式细胞术Annexin V APC/7-AAD双染检测细胞凋亡水平,探究上述各组放射的敏感性的差异;对上述各组进行不同剂量梯度的照射,并采用集落生成实验及CCK8细胞增殖实验验证miR-34c对鼻咽癌细胞放射抗拒的影响。2.利用qRT-PCR的方法,探究空白对照组（blank组）、miR-34c空载组（miR-ctrl组）、miR-34c上调组（miR-34c-m组）、miR-34c下调组（miR-34c-i组）中β-catenin m RNA水平的差异;利用Western blot的方法,探究上述各组中中β-catenin的蛋白表达量的差异;对β-catenin的3’UTR区域中miR-34c的可能结合位点进行生物信息学预测,并以此为基础构建相应3’UTR区域的突变型（MUT）和野生型（WT）序列,其中,野生型序列包含miR-34c潜在结合位点,而突变型序列由于碱基的替换,将不能被miR-34c识别并结合。将突变型或野生型序列分别插入至含有荧光素酶序列的质粒中,构建成报告基因载体。将野生型或突变型报告基因载体与miR-34c同时转染进入HEK293T中,检测荧光强度以验证miR-34c对β-catenin m RNA的直接靶向作用;将细胞分为空载对照组（miR-Ctrl+vector组）、miR-34c过表达组（mir-34c-m组）和同时过表达miR-34c及βcatenin组（mir-34c-m+β-catenin组）。利用Rescue实验（挽救实验）,检验各组鼻咽癌细胞的侵袭迁移能力（transwell实验）及增殖能力（集落形成实验和cck8实验）,证实miR-34c通过靶向β-catenin分子抑制鼻咽癌细胞的侵袭迁移及增殖能力;通过Rescue实验,对同时过表达miR-34c及β-catenin的CNE-2R细胞系进行不同剂量梯度的照射,以集落生成实验验证其对放射的敏感性,验证β-catenin在miR-34c增强放射敏感性过程中起到中介作用;将mir-34c-m组或其对照miR-Ctrl的CNE-2R细胞接种到BALB/c裸鼠皮下,并将裸鼠分为0 Gy（不放射）组和8 Gy（放射）组,对放组裸射鼠,在种瘤第24天进行单次8 Gy的照射。每三日对裸鼠肿瘤体积进行一次测算,绘制体积增长曲线及放射后肿瘤生长率曲线。第36天处死裸鼠,取瘤称重。对裸鼠肿瘤石蜡切片进行EMT、增殖及凋亡相关指标的免疫组织化学染色,并对β-catenin分子进行染色和统计分析,在体内证实过表达miR-34c对鼻咽癌组织中β-catenin表达的下调作用。3.利用慢病毒转染技术,对MSC进行转染,转染空载病毒或上调其miR-34c的表达量,提取其外泌体（分别为MSC-exo-NC组和MSC-exo-miR-34c组）,并通过Western blot以及nanosight等方法验证其纯度以及粒子大小。利用PCR技术对转染后的MSC及其外泌体中miR-34c的表达水平进行验证;利用Transwell实验、CCK8实验以及集落形成实验,检测上述各组外泌体刺激鼻咽癌细胞后,细胞增殖水平以及迁移能力;利用流式细胞术Annexin V APC/7-AAD双染检测外泌体刺激后的鼻咽癌细胞凋亡水平及放射敏感性;对MSC-exo-miR-34c刺激后的放射抗拒鼻咽癌细胞系CNE-2R进行不同剂量梯度的照射,进行集落生成实验,利用线性二次模型绘制生存曲线,并进行CCK8实验,验证miR-34c对鼻咽癌细胞放射抗拒的影响;将CNE-2R细胞接种到BALB/c裸鼠皮下,建立裸鼠放射抗拒鼻咽癌模型。并在种瘤第7天起持续14天对裸鼠静脉注射MSC-exo-miR-34c、未高表达miR-34c的外泌体（MSC-exo-NC）或PBS,第24天进行单次8 Gy的照射。每三日对裸鼠肿瘤体积进行一次测算,绘制体积增长曲线及放射后肿瘤生长率曲线。第36天处死裸鼠,取瘤称重。对裸鼠肿瘤石蜡切片进行EMT、增殖及凋亡相关指标的免疫组织化学染色,从体内验证MSC-exo-miR-34c对鼻咽癌EMT、增殖、凋亡以及放射抗拒的作用。结果:1.对NP-69、CNE-2和CNE-2R细胞系中micro RNA表达量的测序结果显示,miR-34c在鼻咽癌细胞系CNE-2中的表达量低于其在永生化鼻咽部上皮细胞系NP-69中的表达量;且其在放射抗拒鼻咽癌细胞系CNE-2R中表达量最低;对正常鼻咽部组织和鼻咽癌组织中miR-34c表达量的分析显示,miR-34c在鼻咽癌组织中的含量明显下降;且低表达miR-34c的鼻咽癌病人其生存期更短;过表达miR-34c抑制了鼻咽癌细胞的侵袭迁移、集落形成及增殖能力;抑制其表达则显著促进了以上的恶性行为;Western blot结果显示miR-34c抑制EMT及侵袭迁移相关蛋白在鼻咽癌细胞中的表达;过表达miR-34c促进了8 Gy照射对鼻咽癌细胞凋亡的诱导能力;而敲减miR-34c则抑制了放射诱导的细胞凋亡;集落生成及CCK8细胞增殖实验结果显示,随着照射剂量的增加,过表达miR-34c的CNE-2R细胞系表现出更明显的集落形成及增殖能力的抑制现象;而敲减miR-34c的CNE-2R细胞系对放射的抗拒明显增加。2.过表达及敲减miR-34c分别能够下调或上调β-catenin m RNA在鼻咽癌细胞中的含量;Western blot结果显示,过表达或敲减miR-34c的鼻咽癌细胞系中β-catenin的蛋白表达量分别出现下调及上调;荧光素酶报告基因实验结果显示,过表达miR-34c可以下调转染野生型报告基因载体的HEK293T细胞的荧光,而对转染突变型报告基因载体的HEK293T细胞,miR-34c不具备使其荧光下调的能力;过表达β-catenin可以挽救miR-34c所致鼻咽癌细胞的侵袭迁移能力及增殖能力的下降;CNE-2R细胞中被miR-34c所抑制的放射抗拒可以被β-catenin过表达挽救。miR-34c过表达可明显减小裸鼠皮下肿瘤的体积和重量,且该抑制作用在照射条件下更加显著;对照射后肿瘤生长率曲线的分析显示,在接受放射后,过表达miR-34c的肿瘤其生长率下降更快。免疫组化结果显示,过表达miR-34c抑制了肿瘤的EMT过程及肿瘤的增殖活性,并明显减少了β-catenin的表达量。此外,对于接受放射的肿瘤,过表达miR-34c明显增加了其中凋亡细胞的比例。3.成功对MSC进行转染,阳性率85%以上,PCR显示转染后MSC的miR-34c含量明显上调。成功提取其外泌体,Western blot实验显示TSG101以及CD9高表达,calnexin则不表达,nanosight显示提取粒子直径在50-150纳米之间,证实提取的粒子是外泌体。PCR证明MSC-exo-miR-34c的miR-34c表达水平显著上调。Transwell实验显示MSC-exo-miR-34c明显降低了鼻咽癌细胞系的侵袭迁移能力,CCK8实验及集落形成实验表明MSC-exo-miR-34c可显著抑制鼻咽癌细胞的增殖水平;流式细胞术结果显示MSC-exo-miR-34c刺激鼻咽癌细胞的同时进行照射可以显著促进鼻咽癌细胞的凋亡水平;肿瘤生长曲线及CCK8结果表明MSC-exo-miR-34c可显著提升鼻咽癌的放射敏感性;在体积和重量两方面,MSC-exo-miR-34c组裸鼠的肿瘤均低于MSC-exo-NC组,肿瘤生长率曲线显示MSC-exo-miR-34c在压制肿瘤增生的同时,也降低了肿瘤的放射抗性。免疫组织化学染色结果显示,MSC-exo-miR-34c可明显抑制EMT、降低细胞增殖水平,促进鼻咽癌细胞的凋亡。结论:miR-34c在鼻咽癌特别是放射抗拒鼻咽癌中表达量下调,其具有抑制鼻咽癌细胞的侵袭迁移、EMT、集落形成及增殖等恶性行为的能力,并能够诱导鼻咽癌细胞的放射敏感性。miR-34c通过直接靶向β-catenin,在体内外抑制了鼻咽癌的恶性行为及放射抗拒。MSC转染miR-34c后,其外泌体可明显抑制鼻咽癌的侵袭迁移、增殖,并促进其凋亡以及放射敏感性。