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癌症是一类在发病率和死亡率方面仅次于心血管疾病的第二大疾病。其中,发病率和死亡率较高的癌症类型为肺癌、胃癌、皮肤癌、肝癌、结直肠癌、皮肤癌及女性乳腺癌。2015年世界卫生组织调查数据显示,癌症是导致大部分国家人口死亡的第一或第二原因。人体果糖1,6-二磷酸醛缩酶（简称Aldolase）,包括三种同工酶:ALDOA,ALDOB和ALDOC,是人体糖酵解和糖异生过程中的关键调控酶。研究表明,正常细胞通过葡萄糖代谢产生的能量来维持人体正常生命活动。和正常细胞相比,在口腔鳞状细胞癌、肝癌和肺癌等多种肿瘤细胞中,糖酵解水平显著增加,同时Aldolase在肿瘤细胞中的表达量均有不同程度的过表达。大量研究表明可通过抑制Aldolase的活性来达到治疗癌症的效果,同时Aldolase被认为是治疗癌症的新型靶标。基于此,本文首先采用亲和层析技术纯化得到高纯度、高产量、高活性的ALDOA、ALDOB、ALDOC及17个ALDOB突变体蛋白。在此基础上,测试了马来酰亚胺类化合物对Aldolase的抑制效果,分析了构效关系,并对结合模式进行了探究。具体研究工作包括以下三个方面:1、ALDOA、ALDOB、ALDOC的表达纯化体系的建立和酶学性质研究我们将ALDOA、ALDOB和ALDOC基因构建到pET-28a（+）载体上,以大肠杆菌BL21（DE3）为表达菌株,对ALDOA、ALDOB和ALDOC进行异源表达,并对其诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等表达条件进行探索优化,然后通过亲和层析技术成功纯化得到纯度高达95%以上,且高蛋白产量的ALDOA、ALDOB和ALDOC目的蛋白。我们采用酶偶联反应法建立Aldolase的酶活性测试体系,分别测定了反应时间、温度、pH以及TPI酶含量和GPDH酶含量对ALDOA、ALDOB和ALDOC酶活性的影响,确定了最适的反应条件,并对三种酶的酶动力学常数进行测定。2、马来酰亚胺类化合物对ALDOA、ALDOB和ALDOC的抑制效果我们测定本课题组前期合成的33个马来酰亚胺类化合物对三种同工酶的抑制效果。化合物 127 对 ALDOA 的 IC50 为 60.04±3.50 对 ALDOB 的 IC50 为 1.20±0.16 μM,对 ALDOC 的 IC50为 80.92±2.08 μM。相对于 ALDOB,化合物 127 对ALDOA和ALDOC的抑制效果分别降低50倍和67倍,该结果表明化合物127具有较好的选择性,选择性分别达到50倍和67倍。我们以化合物127为探针分子,通过理论预测和定点突变实验探究马来酰亚胺类化合物与ALDOB的结合方式,发现该类化合物与ALDOB的多个半胱氨酸发生共价结合抑制ALDOB的活性。为后续以Aldolase为靶标的抑制剂设计和改造提供了理论指导和思路。3、ALDOA和ALDOB结晶条件筛选与优化为进一步研究Aldolase与马来酰亚胺类化合物的作用机理,我们对ALDOA、ALDOB及复合物晶体进行培养,首先是结晶条件的筛选,然后根据出晶情况和出晶条件,对沉淀剂、盐浓度、缓冲液及pH等进行优化,最终得到衍射质量较好的ALDOA的晶体,为后续结构生物学研究奠定基础。