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【目的】1.分离、培养扩增和鉴定猪BMSCs。2.构建TGF-β1重组慢病毒表达载体,并转染BMSCs,为骨软骨组织工程修复提供持续高效的种子细胞。3.制备胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石支架材料并检测其生物相容性。【方法】1.分离、培养扩增和鉴定猪BMSCs:联合应用密度梯度离心法及贴壁培养法分离、培养扩增猪BMSCs,并应用流式细胞仪鉴定BMSCs表面相对特异性分子(CD90、CD105、CD45 )的阳性率以明确BMSCs的纯度。2.构建TGF-β1重组慢病毒表达载体,并转染BMSCs:将已提取的目的基因TGF-β1cDNA包装至慢病毒载体中,通过PCR及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并用Real-time PCR检测慢病毒滴度;利用TGF-β1重组慢病毒转染BMSCs,通过Western blot、RT-PCR,免疫细胞化学、Elisa等方法检测TGF-β1基因及蛋白在BMSCs中的表达情况,以明确转染效果。3.制备胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石支架材料并检测其生物相容性:由清华大学研发和制备出胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石支架材料,并依据相关标准选择急性全身毒性试验、皮内刺激试验、热原试验、溶血试验、体外细胞毒性试验及骨植入试验检测胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石支架材料的生物相容性。【结果】1.联合应用密度梯度离心法及贴壁培养法成功分离、培养扩增猪BMSCs,流式细胞仪检测细胞表面相对特异性分子的阳性表达率显示:CD90为91.2%,CD105为93.5%,CD45为4.4%。2.经PCR及基因测序鉴定TGF-β1重组慢病毒表达载体构建成功,测定滴度为2×109TU/ml;以慢病毒为载体,将TGF-β1基因导入猪BMSCs,经Western blot、RT-PCR、免疫细胞化学及Elisa提示TGF-β1基因成功导入BMSCs,并表达TGF-β1蛋白。3.胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石支架材料的急性全身毒性试验、皮内刺激试验、热原试验、溶血试验、体外细胞毒性试验均符合相关标准,骨植入试验显示支架材料与周边组织相容性好。【结论】1.联合应用密度梯度离心法及贴壁培养法可以获取纯度较高的猪BMSCs。2.成功构建TGF-β1重组慢病毒表达载体,并成功转染BMSCs,TGF-β1基因可长期、稳定表达。3.成功制备出生物相容性良好的胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石支架材料。