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龟裂链霉菌是生产四环类土霉素的产生菌,土霉素广泛应用于农业和渔业等领域,提高土霉素的生物合成能力是目前重要研究内容。为此,本论文拟构建一个适合龟裂链霉菌13C代谢通量分析的技术,并通过对龟裂链霉菌的代谢网络通量进行确定,为今后分析龟裂链霉菌生产土霉素基因新的基因改造靶点提供指导依据。本文研究结果如下：1.开发一种适合龟裂链霉菌13C代谢通量分析的无机氮源合成培养基。首先通过比较龟裂链霉菌模式菌株M4018在12种有机氮源和9种无机氮源上的生长和土霉素生物合成水平,确定了以硝酸钾为主要无机氮源的初始S-4合成培养基。随后进一步通过响应面分析,确定了S-4合成培养基配方的最佳组成。在S-4培养基上M4018菌体干重达6.32g/L,土霉素达至145.6mg/L,基本接近有机氮源的发酵水平,并成功排除额外碳源的干扰。2.构建龟裂链霉菌中心代谢网络模型。以S. rimosus M4018的部分已知基因组信息和生物量组成信息为基础构建了其中心碳代谢网络模型,并通过13C标记实验结果验证和修正,构建了龟裂链霉菌合理的中心碳代谢网络模型。该模型中存在两类回补途径,并在代谢流水平上首次证明龟裂链霉菌中不存在ED途径活力,为后续13C-MFA在龟裂链霉菌中的深入应用奠定了基础。3.建立了龟裂链霉菌13C代谢通量分析方法。采用100%1-13葡萄糖和20%U-13C葡萄糖标记策略,并利用建立的龟裂链霉菌13C代谢通量分析方法,同时结合宏观生理参数考察了初级代谢途径中zwf1基因和次级代谢途径中oxyABC基因对S. rimosus M4018在土霉素合成启动时中心碳代谢的调控。结果发现当在M4018中阻断zwf1基因表达或者敲入oxyABC基因后,土霉素合成能力都明显增强,通过13C标记实验分析发现此时这两类突变株的PPP途径会相应的减弱,EMP途径和TCA循环通量都有所增加。这可能是PPP途径所提供的还原力已经超过土霉素合成过程中所需量,此时过多的碳流流向PPP途径会造成碳骨架的浪费,而EMP途径能够提供土霉素合成过程中所需的前体物质乙酰CoA。