论文部分内容阅读
目的:基于一个疑似口面指综合征VI型家系的遗传学分析,为其遗传咨询及产前诊断提供依据;研究CPLANE1基因对小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3t3)及其初级纤毛的影响,初步探讨CPLANE1基因的功能。方法:1.收集家系中先证者相关产前检查结果,询问孕妇详细妊娠史及家族史;2.结合先证者临床特点对家系成员进行全外显子测序及生物信息学分析,完善染色体核型分析、拷贝数变异等相关检查;3.对检测到的可疑致病突变进行Sanger测序验证,检索Clinvar、OMIM、HGMD等相关数据库,绘制家系图;4.结合测序及生信分析结果,认为致病基因为CPLANE1基因,设计合成三条CPLANE1-si RNA和一条阴性对照si RNA,在NIH/3t3细胞上运用脂质体Lipo2000转染si RNA的方法干扰CPLANE1基因表达,摸索最适转染条件(如转染时间、转染试剂比例、细胞密度等),并通过RT-q PCR筛选出一条干扰效率最高的CPLANE1-si RNA;5.找到最适转染条件及干扰效率最高的si RNA后,实验分为四组进行:空白对照组、Lipo2000对照组、NC-si RNA组、CPLANE1-si RNA组,分别利用CCK-8法研究细胞活性、流式细胞术研究细胞凋亡及周期、Transwell研究细胞迁移情况;6.利用细胞免疫荧光染色对四组细胞的纤毛进行观察:Acetyl K40标记纤毛体部,γ-Tubulin标记纤毛基部,DAPI标记细胞核。结果:1.先证者系其母亲第三次妊娠,产前超声提示其颅后凹“Blake”囊肿,双足多趾畸形。先证者母亲第一次妊娠时,产前超声提示该胎儿胼胝体发育不全,小脑蚓部发育不良,双手轴后多指畸形。先证者母亲第二次妊娠时,不明原因流产。先证者母亲第四次妊娠已产下一名健康婴儿。夫妻双方否认近亲结婚,否认疾病家族史;2.全外显子测序结合临床表型发现先证者CPLANE1基因上存在复合杂合突变,其母亲携带A错义突变,其父亲携带B剪切突变,先证者弟弟/妹妹在A、B位点上均为野生纯合子。先证者及其弟弟/妹妹的染色体核型分析、拷贝数变异检查结果均无异常;3.经过一代测序验证及数据库查询,软件分析认为CPLANE1基因A错义突变为一个意义不明突变(偏向致病),B剪切突变为致病突变。综上,认为先证者为口面指综合征VI型。根据以上信息绘制家系图;4.经过条件摸索筛选出干扰效率最高的si RNA,CPLANE1干扰效率可达90%。采用此条件进行后续实验;5.CCK-8实验表明,CPLANE1-si RNA组细胞活性相较于NC-si RNA组呈显著降低(p<0.01);细胞凋亡实验表明,CPLANE1-si RNA组相较于NC-si RNA组,细胞凋亡增加(p<0.05);细胞周期实验表明,空白对照组、Lipo2000对照组、NC-si RNA组、CPLANE1-si RNA组细胞在G1期、S期、G2期所占比例无显著差异(p>0.05);Transwell实验表明,CPLANE1-si RNA组细胞迁移数明显多于NC-si RNA转染组(p<0.01);6.对纤毛进行免疫荧光染色后,空白对照组、Lipo2000对照组、NC-si RNA组约70%～76%的细胞可见纤毛结构,每个细胞有且仅有一根纤毛,长度在5～10μm之间,CPLANE1-si RNA组细胞的纤毛数量明显少于NC-si RNA转染组(p<0.01)。结论:1.本研究通过基因检测及生信分析发现一个疑似口面指综合征VI型的家系,为该家系的遗传咨询及产前诊断提供有力帮助,具有社会价值;2.实验证明,干扰CPLANE1基因表达后,NIH/3t3细胞活性降低、凋亡率增加、迁移率降低,但周期不受影响。3.CPLANE1低表达导致NIH/3t3细胞上的纤毛数量显著减少。