高度异质性和可塑性是单核-巨噬细胞的主要特征。作为天然免疫系统的重要组成成分，巨噬细胞不仅介导炎症反应，保护机体不受外源病原体的侵犯，还参与器官重塑以及维持稳态。并且，在不同类型的炎症性疾病，或者同一疾病的不同阶段，巨噬细胞的功能表型变化起到至关重要的作用。因此，探究巨噬细胞极化的调控机制，寻找选择性的干预手段，将为巨噬细胞相关疾病的诊断和治疗打下基础。　　本文的命题是巨噬细胞的极化调控，在第一章综述了巨噬细胞极化调控的相关研究进展基础上，提出针对巨噬细胞的调控对于治疗相关炎症疾病的重要性，因而需要寻找巨噬细胞极化调控的新机制。为实现这一目标，首先通过分析M1极化与M0型巨噬细胞的差异蛋白，发现了位于胞浆的脱氧鸟苷激酶(Deoxyguanosine kinase，dGK)可作为新的调控分子诱导巨噬细胞的M1极化。但是，由于dGK广泛存在于多种组织细胞以及自身蛋白特性的限制，使得借助dGK对巨噬细胞表型的调控改善炎症性疾病的设想缺乏靶向性，需要大量的研究来对其进行优化。因此，我们进一步借助小分子化合物寻找新的特异性靶标，并藉此更加全面的考察巨噬细胞极化的调控机制。通过筛选一系列化合物，发现了具有独特生物活性的小分子SND67，证实其可通过调控TRAF6介导的“分子开关”样作用诱导巨噬细胞表型发生转换，初步探讨了TRAF6“分子开关”样作用的结构基础。这些发现丰富了巨噬细胞极化的调控体系，为炎症性疾病的治疗提供了新的切入点。　　在第二章中，我们通过与M0型细胞比较分析M1型细胞的蛋白表达，发现脱氧鸟苷激酶(dGK)在其中起着重要的作用。dGK敲低显著抑制巨噬细胞的M1极化，STAT1磷酸化水平明显降低，但是NF-κB活化水平没有明显变化。dGK对M2极化的影响并不明确。相反，过表达dGK促进M1相关指标的表达，进一步使用Jak的激动剂IFN-γ和抑制剂托法替尼以及dGK遗传操纵等方法探究其确切的作用位点，发现dGK敲低使得STAT1的磷酸化降低，Jak2抑制剂也有相同的效果。但是，当dGK过表达时，即使使用Jak2抑制剂，STAT1仍然可以被磷酸化。这些实验结果表明，dGK使得STAT1被Jak2的磷酸化更容易。我们注意到，在M1极化的后期，即炎症消退阶段，dGK的蛋白水平明显降低。巨噬细胞由于功能的可塑性，既可以参与炎症的起始阶段，也可以在炎症的消退阶段发挥作用，但是其功能转换机制尚不明确，dGK的上述作用可为这一现象提供解释。M1型巨噬细胞在极化后期自噬水平上调，同时dGK蛋白水平下降。在随后的一系列实验中证明，M1极化过程中产生的自噬介导了dGK的降解，造成STAT1的磷酸化活化减弱。因此，巨噬细胞的M1极化得到抑制。使用自噬激动剂引起dGK降解的同时，M1型细胞相关因子的表达水平也显著下调。这一发现不仅完善了dGK对M1的调控机制，也为自噬对巨噬细胞极化的调控提供了新的研究方向。为了在体内验证dGK的作用，我们将dGK敲低的BMDM回输到剔除巨噬细胞的小鼠体内。结果表明，dGK敲低的M1型BMDM在体内并不能发挥促炎作用，即巨噬细胞的M1表型被削弱。这些结果表明，dGK对巨噬细胞的M1极化起到促进作用。　　但是，dGK对维持细胞内线粒体稳态有着重要的作用，目前，尚无有效的手段区分其线粒体以及胞浆亚型，这使得靶向胞浆dGK调控巨噬细胞M1极化的研究仍然处于起步阶段。因此我们进行了其他的尝试，借助小分子化合物的独特活性，发现靶向调控巨噬细胞极化的新机制。实验室前期研究发现了具有独特活性的青藤碱衍生物SND67，可诱导巨噬细胞表型从M1向M2转化。在第三章，我们对该化合物的作用机制进行进一步研究，发现SND67对经典的STATl/STAT6通路及转录因子IRF5和IRF4的蛋白表达水平均无明显影响。但是，SND67抑制IRF5的入核，同时促进了M2型细胞相关转录因子IRF4的入核。进一步的实验结果显示，在SND67作用下，TRAF6与IRF5的结合被抑制，导致IRF5信号通路阻断、巨噬细胞的M1极化减弱。同时，SND67促进TRAF6与IRF4的结合，并且增强IRF4的泛素化水平。这些结果表明，在SND67的作用下，TRAF6介导IRF4的泛素化活化，从而启动IRF4的转录活性，最终使得细胞在M1极化刺激条件下产生M2表型，达到治疗炎症的目的。　　随后，我们进行体内实验证实了SND67具有良好的抗炎功效，可以显著缓解胶原诱导的小鼠类风湿性关节炎。给予SND67的小鼠临床评分以及发病率下降。进一步的病理分析显示，给药组小鼠关节处骨破坏被抑制，炎症细胞浸润减少。血清学检测则表明，小鼠血液中Ⅱ型胶原抗体以及促炎因子均被显著抑制。这些结果表明，SND67通过抑制炎症反应改善了小鼠的类风湿性关节炎。此外，SND67对LPS诱导的急性炎症反应也有明显改善作用，降低了血清炎症因子水平、提高了小鼠存活率。激光共聚焦实验结果显示，给药组小鼠腹腔巨噬细胞中TRAF6与IRF4的共定位增加，证实SND67的作用机制在于通过调控TRAF6与IRF4的相互作用改善机体炎症。　　在第四章，我们继续深入研究SND67对TRAF6的靶向作用，并筛选SND67的活性基团。Sepharose6B微珠耦联的SND67pulldown实验以及包内热迁移实验表明SND67在细胞内可能靶向于TRAF6。而且敲低TRAF6后，SND67对巨噬细胞表型转化的调控作用消失，表明SND67通过TRAF6发挥作用。借助SPR等方法证实SND67与TRAF6可能发生直接结合。然而，SND67与IRF4并无明显的结合趋势。另一方面，通过对SND67结构类似物的筛选，我们发现SND67的A环和C环均对巨噬细胞的表型调控作用至关重要，A环添加长链取代基或者C环取代基可能对SND67与TRAF6的相互作用起到阻碍作用。在第五章，我们继续探究SND67通过调控TRAF6改变巨噬细胞极化表型的机制。通过一系列TRAF6截短体与突变体的使用，我们发现，TRAF6的Ringdomain对二者的结合是必需的，而且TRAF6酶活位点失活突变体(TRAF6-C70A)并不能使IRF4发生泛素化，提示TRAF6参与介导IRF4泛素化活化。同时，与TRAF6失活突变的结果一致，敲低TRAF6后IRF4的泛素化水平也随之下调，其中，核内IRF4更多地表现为K63-泛素化形式，证明K63-泛素化为IRF4的活化形式。我们随后使用无细胞体系验证二者的直接结合。实验结果显示，TRAF6与IRF4的结合常数在1μM左右，为中等强度结合，便于进行调控。与SND67共孵之后的TRAF6却能结合更多的IRF4。这表明，SND67作用下，TRAF6构象发生了一定变化，从而使得与IRF4的亲和性增强，改变了下游信号转导过程，最终导致巨噬细胞转为M2表型。　　综上所述，本课题基于巨噬细胞的极化模型，发现了两个新的调控分子。胞浆dGK通过促进STAT1的活化促进M1极化，在炎症消退阶段，该蛋白通过自噬途径降解，使细胞的炎症反应平复。另一方面，基于对小分子化合物SND67作用机制的研究，发现TRAF6介导的“分子开关”样作用对巨噬细胞极化的新型调控方式。在M1刺激存在的情况下，SND67靶向于TRAF6，阻断TRAF6与IRF5的相互作用，开启TRAF6与IRF4的相互作用，表达M2型细胞相关基因，最终使得巨噬细胞表型发生转换。SND67的独特作用最终表现为通过合理干预某些关键步骤扭转已偏移的极化失衡，这种分子开关转换的思想为今后相关药物的开发提供了新的方向。这些发现进一步阐述了巨噬细胞极化的调控机制。dGK作为新发现的调控蛋白，TRAF6作为重要的关键节点蛋白，为巨噬细胞相关的炎症性疾病，代谢性疾病以及肿瘤提供了新的治疗策略。