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黑色素瘤是起源于皮肤色素细胞的一种恶性肿瘤,易发生转移,目前尚无特异有效药物治疗其扩散性病变。流行病学研究表明,饮食中多不饱和脂肪酸含量与黑色素瘤的发生密切相关。花生四烯酸是多不饱和脂肪酸的主要成分,其脂氧合酶代谢产物在黑色素瘤的转移过程中起重要作用。本研究通过考察5-脂氧合酶抑制剂对黑色素瘤细胞a375转移过程中相关因素的影响,阐明5-脂氧合酶抑制剂影响黑色素瘤转移的作用机制,为研制开发抗黑色素瘤转移药物提供思路。 实验采用光密度法测定黑色素瘤细胞a375与细胞外基质蛋白的粘附率:以流式细胞仪测定a375细胞表面整合素的表达;以酶联免疫吸附法、流式细胞仪、蛋白质印迹分析测定a375细胞ICAM-1的表达,以Northern blot测定a375细胞ICAM-1的mRNA的表达水平;以双抗体夹心法检测a375细胞NF-κB的活化水平。 以滤膜涂布Matrigel基质的Transwell Chamber测定a375细胞的侵袭能力;以明胶酶谱法测定a375细胞分泌MMP-2和MMP-9的酶活性;以蛋白质印迹分析测定a375细胞产生MMP-2、MMP-9和TIMP-1的蛋白量;以Northern blot测定a375细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1的mRNA表达水平。 实验结果表明:作为对照的环氧合酶抑制剂吲哚美辛作用后,对黑色素瘤细胞a375与细胞外基质的粘附率没有影响。在5-20μM浓度范围内,非选择性脂氧合酶抑制剂NDGA、5-脂氧合酶抑制剂AA861和5-脂氧合酶激动蛋白抑制剂MK886剂量依赖性地抑制a375细胞对Ⅳ型胶原的粘附,对细胞粘附至纤维粘连蛋白及层粘连蛋白没有影响。抑制剂对a375细胞粘附的抑制作用能被5-脂氧合酶代谢产物5-HETE所逆转,白三烯类对a375细胞粘附性改变无明显作用。 作用浓度为20μM时,NDGA、AA861及MK886能明显抑制细胞内[Ca2+]升高导致的a375细胞对Ⅳ型胶原粘附率的增加,对a375细胞PKC活化导致对Ⅳ型胶原粘附增加只有部分抑制作用。 相同浓度的NDGA、AA861及MK886作用后,明显降低a375细胞表面的整合素β1表达,对细胞整合素αⅡbβ3的表达基本没有影响。 吲哚美辛对a375细胞ICAM-1表达没有明显影响,在5~20μM浓度范围内,NDGA、AA861及MK886剂量依赖性地降低a375细胞ICAM-1蛋白表达量及mRNA表达水平。NDGA、AA861及MK886作用后,剂量依赖性地抑制a375细胞NF aB活化。 叼噪美辛对a375细胞侵袭重组基底膜能力没有明显影响,NDGA、AA861 和MK886剂量依赖性地抑制a375细胞对Matytael膜的侵袭。这种抑制作用能被5-HETE逆转,白三烯类对0乃细胞的侵袭性改变没有明显影响。 作用浓度为20 p M时,NDGA、AA861及MK886显著抑制a375细胞产生MMP-2和 MMP-9蛋白量及其InRNA表达水平,对a375细胞产生 TIMPI的蛋白量及mRNA表达水平没有明显影响。 这些结果表明,5.脂氧合酶代谢产物的其中一种,5-HETE,在黑色素瘤转移过程中起重要的作用。证实5-脂氧合酶抑制剂通过抑制a375细胞核转录因子活化,在基因转录水平抑制a3 75细胞粘附分子的表达,进而抑制a375细胞对细胞外基质的粘附。5-脂氧合酶抑制剂通过抑制 a375细胞产生、分泌IV型胶原酶,降低 a375细胞对重组基底膜的侵袭性。 本研究结果提示5.脂氧合酶抑制剂作为可能的抗黑色素瘤转移药物,值得深入研究。