长春花含有长春质碱、文多灵、阿玛碱、长春碱和长春新碱等130种以上具有抗肿瘤活性的萜类吲哚生物碱。但是，长春花中生物碱含量较低，目前国内外大多是通过毛状根和细胞组织培养的策略来获得生物碱，但毛状根和悬浮细胞不能合成重要的抗肿瘤生物碱长春碱和长春新碱，使得大规模商业化生产受到了限制。有研究表明，外源施加植物激素能提高长春花吲哚生物碱的含量。茉莉酸是一类非常重要的植物激素，对植物的生长发育、系统防御以及次生代谢产物的合成起着关键的调控作用。长春花中转录因子ORCA3受甲基茉莉酸诱导，同时ORCA3又可以增强生物碱生物合成代谢途径上多个基因，包括DXS、ASA、TDC、STR、D4H的表达。有研究已证实外源的甲基茉莉酸能够提高长春花悬浮细胞和毛状根中次生代谢产物的积累。因此，有望通过对茉莉酸生物合成途径关键酶基因的操作来代替繁琐的外源激素处理，从而提高目的产物的含量。所以，克隆并研究茉莉酸生物合成途径的关键酶基因，是后续工作的基础和关键。在植物的茉莉酸生物合成途径中，丙二烯氧化物合成酶（AOS）和丙二烯氧化物环化酶（AOC）的催化步骤是最重要的限速步骤。为了研究长春花茉莉酸合成途径基因的功能以及它们在长春花次生代谢中的作用，从长春花中克隆了CrAOS和CrAOC基因，并进行基因生物信息学分析，及基因在长春花不同组织和不同胁迫下的表达变化，了解到基因及其编码蛋白的一些基本特性，为进一步在长春花中的基因工程奠定基础。研究取得的结果如下：1）长春花丙二烯氧化物合酶基因（CrAOS）的克隆与表达分析利用RT-PCR和RACE相结合的方法，从长春花中克隆了丙二烯氧化物合酶基因。长春花AOS基因（命名为CrAOS，GenBank登录号为JQ364955）cDNA全长为2118bp，包括5’和3’非翻译区，polyA尾和一个长1638bp的开放阅读框，其基因组中不含内含子；CrAOS基因编码的蛋白含545个氨基酸，多重比对表明CrAOS蛋白与其他物种的AOS蛋白具有较高的相似性，CrAOS蛋白序列中含有AOS家族应有的保守氨基酸残基。Southern杂交表明，CrAOS基因在长春花中为低拷贝。RT-qPCR结果显示，CrAOS在各个组织均有表达但表达量存在差异，在老叶中最高，在幼花中表达最低。对长春花幼苗进行不同处理，结果表明：伤害、低温、甲基茉莉酸、乙烯利处理等可使CrAOS基因表达量显著提高，水杨酸处理对基因表达影响不大。2）长春花丙二烯氧化物环化酶基因（CrAOC）的克隆与表达分析此次克隆共获得CrAOC基因cDNA序列1049bp，其中包括5′端非编码序列122bp，171bp3′端非编码序列和756bp的开放阅读框，编码251个氨基酸。DNA序列中含有两个内含子，位于cDNA序列的354~355bp和478~479bp之间。CrAOC基因的GenBank登录号为JQ364956。多重比对表明CrAOC蛋白与其他物种的AOC蛋白具有较高的相似性。Southern杂交表明，CrAOC基因在长春花中为单拷贝。RT-qPCR结果显示，CrAOC在各个组织均有表达，其中在花中表达量最高，其次是茎，在叶中的表达量稍高于根中的表达量。对长春花幼苗进行不同处理，结果表明：伤害、甲基茉莉酸、乙烯利及水杨酸处理可使CrAOC基因表达量显著提高，而低温处理对基因表达影响不显著。对长春花幼苗时期的植株进行外源甲基茉莉酸喷洒处理，发现其中的文多灵、长春质碱、长春碱的含量有所提高，而长春碱的前体物质脱水长春碱含量下降，以此推测经甲基茉莉酸处理后脱水长春碱更多的流向下游合成长春碱。3）长春花CrAOC基因转化烟草提高烟草中尼古丁含量丙二烯氧化物环化酶的催化是植物JA合成途径中最关键的步骤，为了验证JA生物合成途径的基因工程能否使受其诱导的次生代谢产物的含量增加，构建了含长春花CrAOC单基因过量表达载体（pCAMBIA2300-AOC），将该基因转入烟草，以尼古丁含量为代表来验证CrAOC表达对次生代谢产物含量的影响。HPLC分析结果显示其尼古丁含量有不同程度的提高。因而，本研究推测JA生物合成途径关键酶的过表达可以代替繁琐的外源激素处理来提高目的产物的含量，从而为生产受JA诱导的次生代谢产物提供了一个有效的基因工程策略。