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一、研究目的及意义:黑色素瘤是一种恶性程度很高的肿瘤,多发于皮肤、内脏,发病率有逐年增加趋势,临床治疗效果差,死亡率高。随着分子生物学和现代科学技术的发展,基因疗法尤其是自杀基因疗法的应用给黑色素瘤患者带来了希望。数十年来国内外都在不断开展基因治疗的实验和临床研究,但是一些技术问题尚未得到有效的解决,例如自杀基因前药活性低、毒性大,载体转染效率较低、靶向性不够,这些问题成为自杀基因系统治疗效果的制约因素,其结果是肿瘤基因治疗远没有达到所期望的效果。自杀基因治疗的优势是旁杀伤效应,利用旁杀伤效应可以扩大肿瘤自杀基因治疗的效果。中药方药具有多靶点、多途径作用的特点及广泛的药理作用,而且中药方药具有价格低廉、毒副作用小的优点。中药方药联合基因治疗成为我们治疗肿瘤的一种崭新的尝试。本课题前期研究结果:体内体外实验表明滋阴补肾经典名方六味地黄丸可以提高自杀基因系统对肿瘤杀伤效应。任何药物发挥药效必有其作用的物质基础,六味地黄丸提高肿瘤自杀基因系统杀伤效应的物质基础是什么?通过何种机制发挥效应?在前期研究的基础上,我们提出研究假说:“六味地黄丸主要血中移行成分是六味地黄丸提高肿瘤自杀基因系统杀伤效应的物质基础”,并对该假设进行了验证。二、研究方法:1.六味地黄丸主要血中移行成分对tk/GCV系统杀伤黑色素瘤B16细胞效应的影响:将B16、B16/tk细胞混合成B16/tk细胞占20%的比例共同培养,丹皮酚、马钱素、莫诺苷、獐牙菜苷、5-羟甲基-2-糠酸以及它们的混合组分与GCV单独和联合作用20%B16/tk细胞72h,前两种单体终浓度为25、50、100μM;后三种单体终浓度为37.5、75、150μM,GCV终浓度为20μM。MTT法检测细胞抑制率。2.含药淋巴细胞培养上清对tk/GCV系统杀伤黑色素瘤B16细胞效应的影响:SD大鼠剖腹取脾,制备脾淋巴细胞悬液,分为含药淋巴上清组和空白淋巴上清组,含药淋巴上清组与5种六味地黄丸血中移行成分混合组分共同培养72h,空白淋巴上清组不加5种单体混合组分培养72h;将B16、B16/tk细胞混合成B16/tk细胞占20%的比例共同培养,含药淋巴上清、空白淋巴上清与GCV单独和联合作用72h,GCV的终浓度为20μM,加入占总培养液体积分数7.5%、15%、30%的含药淋巴上清和空白淋巴上清,MTT法检测细胞抑制率。3.含药淋巴上清提高tk/GCV系统杀伤黑色素瘤B16细胞效应的缝隙连接机制3.1含药淋巴上清对B16细胞株缝隙连接通讯功能的影响:设对照组、5%含药上清组、7.5%含药上清组、10%含药上清组、15%含药上清组、20%含药上清组、30%含药上清组,5%空白上清组、7.5%空白上清组、10%空白上清组、15%空白上清组、20%空白上清组、30%空白上清组,流式细胞仪测定缝隙连接通讯功能,双阴性受体细胞通过缝隙连接被传递入绿色Calcein荧光染料,以检测绿色荧光细胞数量与荧光双阴性受体细胞比值,作为评价缝隙连接通讯功能的指标。3.2含药淋巴上清对B16细胞株缝隙连接通讯功能量效关系的影响:按占培养液总体积10%淋巴上清加入培养体系,设置对照组(加培养液)、0%含药上清组(10%空白上清)、2.5%含药上清组(2.5%含药上清混合7.5%空白上清)、5%含药上清组(5%含药上清混合5%空白上清)、7.5%含药上清组(7.5%含药上清混合2.5%空白上清)、10%含药上清组(10%含药上清);按占培养液总体积15%淋巴上清加入培养体系,设置对照组(加培养液)、0%含药上清组(15%空白上清)、5%含药上清组(5%含药上清混合10%空白上清)、10%含药上清组(10%含药上清混合5%空白上清)、15%含药上清组(15%含药上清),荧光示踪法和流式细胞仪测定缝隙连接通讯功能。3.3含药淋巴上清对B16细胞缝隙连接蛋白Cx43蛋白表达量效关系的影响,按占培养液总体积10%淋巴上清加入培养体系,设置对照组、0%含药上清组、2.5%含药上清组、5%含药上清组、7.5%含药上清组、10%含药上清组;按占培养液总体积15%淋巴上清加入培养体系,设置对照组、0%含药上清组、5%含药上清组、10%含药上清组、15%含药上清组,Western-blot法测定Cx43的蛋白表达量。三、研究结果:1.六味地黄丸血中移行成分对tk/GCV系统杀伤黑色素瘤B16细胞效应无增效作用:GCV联合25μM、50μM、100μM丹皮酚组的实际抑制率为15.79%、17.71%、19.07%,理论抑制率为23.12%、24.46%、29.10%,Q值分别是0.68、0.72、0.66,均小于0.85,为拮抗作用。GCV联合25μM、50μM、100μM马钱素组的实际抑制率(7.92%、11.23%、14.14%)低于理论抑制率(24.35%、25.05%、26.97%),Q值分别为0.33、0.45、0.52,均小于0.85,为拮抗作用。GCV联合37.5μM、75μM、150μM莫诺苷组的实际抑制率为22.20%、20.93%、18.68%,理论抑制率为23.07%、30.75%、28.56%,Q值分别为0.96、0.68、0.65,三者皆小于1.15,为相加或拮抗作用。GCV联合37.5μM、75μM、150μM5-羟甲基-2-糠酸组的实际抑制率6.14%、16.27%、12.11%,理论抑制率19.53%、20.59%、13.33%,Q值分别为0.31、0.79、0.91,三者均小于1.15,为相加或拮抗作用。GCV联合37.5μM、75μM、150μM獐牙菜苷组的细胞实际抑制率(6.36%、19.78%、24.40%)低于理论抑制率(24.47%、28.91%、28.80%),Q值分别为0.26、0.68、0.86,均小于1.15,为拮抗或相加作用。GCV联合0.0033g·L-1、0.0066g·L-1、0.0135g·L-1混合组分组的实际抑制率(4.22%、11.83%、17.77%)低于理论抑制率(19.65%、25.90%、30.32%),Q值分别为0.21、0.46、0.59,均小于0.85,为拮抗作用。2.含药淋巴细胞培养上清能增强tk/GCV系统对黑色素瘤B16细胞杀伤效应:GCV联合体积分数7.5%空白上清、含药上清组的实际抑制率为4.10%、32.23%,理论抑制率21.97%、27.28%,Q值分别为0.19、1.18,前者小于0.85,为拮抗作用,后者大于1.15,为协同作用;GCV联合体积分数15%空白上清、含药上清组的实际抑制率为9.26%、33.92%,理论抑制率为17.76%、25.71%,Q值分别为0.52、1.32,前者小于0.85,为拮抗作用,后者大于1.15,为协同作用;GCV联合体积分数30%空白上清、含药上清组的实际抑制率(32.68%、37.95%)高于理论抑制率(19.78%、29.05%),Q值分别为1.65、1.31,均大于1.15,为协同增效作用。3.含药淋巴细胞上清通过缝隙连接机制提高tk/GCV系统杀伤黑色素瘤B16细胞效应:荧光显微镜观察缝隙连接通讯功能结果显示,体积分数10%含药淋巴上清和15%含药淋巴上清与对照组比较均能明显促进B16细胞间荧光染料Calcein的传递,并呈现剂量-效应关系。流式细胞仪分析缝隙连接通讯功能结果显示,含药淋巴上清与对照组比较传递率有明显升高趋势,并呈现剂量-效应关系。体积分数10%含药淋巴上清和15%含药淋巴上清与对照组比较传递率也有明显升高趋势,并呈现剂量-效应关系,与荧光显微镜观察结果基本一致。Western结果显示体积分数10%含药淋巴上清和15%含药淋巴上清能明显促进Cx43蛋白的表达,并呈现剂量-效应关系。四、结论:实验所得结论为:六味地黄丸五种血中移行成分单体及混合组分对黑色素瘤自杀基因系统无直接增效作用,六味地黄丸血中移行成分淋巴上清对B16细胞自杀基因系统治疗有协同增效作用,认为其增效作用可能是与含药淋巴上清产生的免疫活性物质介导的缝隙连接机制有关。