miR-320c对人牙髓干细胞增殖及分化的影响

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目的:本课题旨在研究miR-320c对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)成骨、成脂能力以及增殖的影响,并分析对于成骨、成脂分化相关基因的影响,为hDPSCs在再生医学中的应用提供理论基础。  方法:1使用酶消化组织块法培养原代牙髓组织来源细胞,并使用流式细胞仪鉴定。2miR-320c mimic及其阴性对照NC(miR-NC组)分别瞬时转染hDPSCs,24h后采用细胞增殖-毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测两组细胞增殖能力;RT-qPCR验证miR-320c在hDPSCs中的表达水平,分别检测两组成骨分化相关基因OCN及Runx2mRNA表达水平,成脂分化相关基因PPAR-γmRNA的基因表达水平;茜素红染色分别检测两组成骨分化能力;油红O染色分别检测两组成脂分化能力。3miR-320c inhibitor及其阴性对照NC(miR-INNC组)分别瞬时转染hDPSCs,24h后采用CCK-8法分别检测两组细胞增殖能力;RT-qPCR验证miR-320c在hDPSCs中的表达水平,分别检测两组成骨分化相关基因OCN及Runx2mRNA表达水平,成脂分化相关基因PPAR-γmRNA的基因表达水平;茜素红染色检测两组成骨分化的能力;油红O染色检测两组成脂分化的能力。  结果:1通过流式细胞术鉴定经酶消化组织块法培养的细胞为CD34-,CD44+,Strol-1+,符合间充质干细胞表面抗原特征,即所得细胞为hDPSCs。2成功在hDPSCs内过表达或敲低miR-320c(P<0.01)。3与miR-NC组相比,过表达miR-320c的hDPSCs增殖活性显著降低(P<0.01);与miR-INNC组相比,敲低miR-320c的hDPSCs增殖活性显著升高(P<0.01)。  结果表明miR-320c负向调控hDPSCs的增殖能力。4茜素红染色结果显示,与miR-NC组相比,过表达miR-320c的hDPSCs钙结节形成明显减少(P<0.05);RT-qPCR结果显示成骨分化相关基因OCN及Runx2的mRNA表达水平均有显著下降趋势(P<0.01)。相反,与miR-INNC组相比,敲低miR-320c的hDPSCs钙结节形成明显增多(P<0.01);RT-qPCR结果显示成骨分化相关基因OCN及Runx2mRNAs表达水平均有显著上升趋势(P<0.01)。以上结果表明,miR-320c负向调控hDPSCs中成骨分化相关基因OCN及Runx2的表达及细胞的成骨分化能力。5油红O染色结果显示,与miR-NC组相比,过表达miR-320c的hDPSCs成脂能力增强;RT-qPCR结果显示成脂分化相关基因PPAR-γ的mRNA表达水平均有显著上升趋势(P<0.01)。与miR-INNC组相比,敲低miR-320c的hDPSCs脂滴形成减少;RT-qPCR结果显示成脂分化相关基因PPAR-γ的mRNA表达水平均有显著下降趋势(P<0.01)。以上结果表明,miR-320c正向调控hDPSCs中成脂分化相关基因PPAR-γ表达及细胞的成脂分化能力。  结论:1应用酶消化组织块法从人牙髓组织中分离培养的细胞为hDPSCs。2miR-320c可负向调控hDPSCs增殖能力。3miR-320c可能通过负向调控成骨分化基因OCN及Runx2mRNAs的水平,负向调控hDPSCs成骨分化能力。4miR-320c可能通过正向调控成脂分化基因PPAR-γmRNA的水平,正向调控hDPSCs成脂分化能力。
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