细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility,CMS）是指雄蕊发育异常,不能产生正常的雄性配子,而雌蕊发育正常能够接受正常花粉而受精结实的一种自然现象,植物界中普遍存在。CMS的育性可以被核基因组中的恢复基因（restorer of fertility,Rf）恢复。红莲型细胞质雄性不育（HL-CMS）属于配子体不育,其不育性可被两个恢复基因Rf5和Rf6分别独立恢复,它们均属于PPR基因家族。Rf6编码一个含894个氨基酸的P家族PPR（pentatricopeptide repeat protein）蛋白,一共含有20个PPR基序,并且PPR基序3,4,5以一个单元的形式在原位重复了一次。而其等位基因rf6的PPR基序3,4,5却未发生重复,丧失了恢复不育性的分子生物学功能。研究表明,这三个重复的PPR基序对于HL-CMS的育性恢复至关重要。由此推测,RF6和rf6两者在结构上势必有很大的差异。同时,研究表明,水稻己糖激酶6（OsHXK6）为HL-CMS的育性恢复复合体成员之一,能够在体内外与RF6互作。除此之外,己糖激酶（HXK）本身是一类多功能蛋白,是植物中唯一能将葡萄糖磷酸化的酶,影响植物从种子萌发到衰老的整个生命过程。本论文从结构生物学入手,试图为HL-CMS的育性恢复机理研究和植物己糖激酶的催化机制提供分子基础。主要研究结果如下:1.利用一步PCR定点突变技术将RF6中的33个半胱氨酸逐个地全部突变为丝氨酸,然后在此基础上对RF6的两端进行了8种方式的序列改造,以期改善其表达和纯化效果。结果表明,RF6的两端序列对其表达和纯化具有很大的影响,一些改造后的RF6在表达和纯化上得到了明显的改善,特别是第二种改造方式,我们将其重新命名为RF6-2。最终,我们将RF6-2在大肠杆菌和真核细胞SF9中进行大量表达,然后纯化出了纯度较高的GST-RF6-2蛋白,并将其进行了初步的晶体筛选。同时,将纯化的蛋白应用到HL-CMS育性恢复机理的功能研究中。我们探索出的改造和纯化RF6的方法可以为其他PPR蛋白的表达纯化提供新思路。2.在大肠杆菌中成功表达OsHXK6（27-506）蛋白,并且纯化出了大量高纯度且构象均一的OsHXK6蛋白。经过晶体筛选和优化,得到了形状好且体积大的晶体,但是在X-射线晶体衍射收集的数据中,晶体分辨率都在3.5?以上。我们根据预测的二级结构设计了OsHXK6截断体（35-506aa）,将N端的无规卷曲去掉,最终得到了3.0?以下的晶体衍射数据。说明蛋白质两端的序列可能对蛋白晶体的生长和质量有很大的影响。同时,我们将OsHXK6截断体与底物葡萄糖和ATP进行共结晶,最终成功解析了OsHXK6截断体及其与不同底物结合的晶体复合物。它们分别是OsHXK6-apo,OsHXK6-Glc,OsHXK6-ADP-PO₄-Mg²⁺和OsHXK6-Glc-ADP-PO₄-Mg²⁺。3.对解析的四个晶体结构分析发现,除了不加任何底物的OsHXK6-apo构象为“开放”状态,其余三个复合物均为“闭合”状态,且结构几乎完全相同。OsHXK6-Glc的结构证明OsHXK6与其它己糖激酶一样,与葡萄糖的结合采取经典的“底物-契合”模型。OsHXK6-ADP-PO₄-Mg²⁺复合物是我们首次捕捉到的己糖激酶催化葡萄糖磷酸化过程的一种中间状态。这个复合物证明,与水解状态ATP结合的己糖激酶呈“闭合”状态,说明ADP-PO₄的结合能使己糖激酶的构象发生变化。将它与OsHXK6-Glc的结构进行重叠后发现,两者的结构几乎完全一样。这个结果说明ADP-PO₄引起己糖激酶构象发生变化的机制与葡萄糖相同。4.两个与ADP-PO₄结合的结构首次揭示了植物己糖激酶与ADP-PO₄的结合模式。ADP的腺嘌呤与Ser369形成氢键;核糖与Leu452和Thr261通过氢键结合;α-PO4与Gly451和Asn114形成氢键;β-PO4和Gly112,Thr113,Thr261通过氢键结合;γ-PO4与Asp109,Asp449,Asp486和Ser488形成氢键。定点突变和体外酶活实验证明,Gly112,Thr261,Gly262和Gly450这四个位点对于维持OsHXK6与ADP-PO₄的结合至关重要。5.通过分析水稻,玉米和拟南芥中所有己糖激酶的序列比对结果发现,它们与底物结合的位点具有高保守性。而且在分析其中8个天然无催化活性的己糖激酶时发现,这8个己糖激酶的某些底物结合位点发生了突变。特别是在Thr261位点,有6个己糖激酶在此位点发生了突变,暗示着这个位点对于维持ATP与己糖激酶的结合很重要。我们猜测这些底物结合位点的突变是引起己糖激酶失活的原因之一。将解析的OsHXK6-Glc-ADP-PO₄-Mg²⁺复合物与人和细菌的己糖激酶-ADP/AMP-PNP进行比较发现,己糖激酶与ATP的结合在细菌,植物和人中具有高度保守性。