基因经过转录、翻译并修饰成为有功能的蛋白质后,才能发挥其特定的生物学作用。在mRNA翻译成蛋白质的过程中,细胞内许多内在调控机制对蛋白质的翻译、加工发挥调节作用,其目的是保证翻译的蛋白质的“量”和“质”都符合机体所需。翻译的蛋白质如果不能正确折叠和／或修饰,将产生无功能甚至对机体有害的蛋白质,后者通过机体的反馈调控机制影响蛋白的翻译水平。当翻译蛋白质的质和量不符合机体需要,将会导致许多病理生理过程的发生,并影响蛋白质的正确折叠和修饰。真核细胞的翻译起始机制是整个蛋白质生成过程的关键信号节点之一。翻译起始需要eIF2(a unit of eukaryotic initiation factor2真核起始因子2亚基)、GTP和tRNA形成三聚体(eIF2-GTP-tRNA),该三聚体是细胞内大部分mRNA翻译的起始部位。当一个mRNA翻译启动后,eIF2结合的GTP转化成GDP,成为无活性的eIF2-GDP形式。正常情况下eIF2B (eukaryotic initiation factor2B,真核起始因子2B)可将与eIF2结合的GDP转变成GTP而恢复为有活性的eIF2-GTP形式,从而导致新的eIF2-GTP-tRNA三聚体形成和启动新一轮的mRNA翻译。在ERs (Endoplasmic Reticulum Stress,内质网应激)或某些病理情况下,eIF2-GTP-tRNA三聚体生成减少而导致大部分mRNA翻译停止,但会启动如ATF4(Activating transcription factor4活化转录因子4)等基因的mRNA翻译。像ATF4这样的基因在正常生理情况下不能被翻译或翻译水平很低,它们的翻译是机体对病理性刺激的一种反应,属于ERs的范畴。体内eIF2α (α unit of eukaryoticInitiation Factor2,真核翻译启动因子2α亚单位)是调控eIF2-GTP-tRNA三聚体数量的关键信号蛋白,它可通过抑制eIF2B的活性而调节eIF2-GTP-tRNA的生成,从而对细胞内mRNA翻译水平发挥重要的调节作用。本研究成功构建了可双向表达ATF4-firefly和renilla的质粒,转染细胞后建立起一个双荧光素酶高通量筛选系统,对含有25,000个小分子化合物的库进行高通量筛选,筛选出了50个eIF2α的小分子激动剂,通过后期验证得到了32个对eIF2α有激动作用的小分子化合物,并对其中的DHBDC (筛选得出的小分子化合物简称)进行了细致的功能验证。我们对DHBDC的研究发现它可以通过PERK(PKR-like endoplasmic reticulum kinase蛋白激酶R样内质网激酶)和PKR (Protein kinaseR蛋白激酶R)途径激活eIF2a,实验结果证实它具有调节内质网应激、杀伤肿瘤细胞和抗HCV病毒的作用。到目前为止,尚未发见特异性PERK和PKR的激动剂及其相关研究领域的报告。论文第一部分高通量筛选eIF2α小分子化合物激动剂本研究成功构建了高通量筛选体系。为在小分子化合物库中快速准确的筛选eIF2α小分子化合物激动剂并对其进行有效地验证奠定基础。1.高通量筛选体系的构建eIF2α具有抑制翻译起始的作用。为尽快高质量的筛选eIF2α小分子激动剂,本实验制作了双荧光素酶报告质粒,并筛选出可稳定表达该双向质粒的细胞株,在此细胞株的基础上实现高通量筛选。该筛选系统的优点是：(1)利用稳定表达细胞株,无需每次都进行转染操作,减少了因每次转染效率不一带来的批间误差；(2)大量减少筛选小分子化合物的工作量,提高了效率；(3)整个筛选过程实现了自动化,减少每次人员操作带来的人工误差；(4)无需重复转染,显著减少了资源浪费。该系统较目前各实验室经常采用的共转染方式,是一种可实现工业化的高通量、可靠地筛选方式。2.构建小分子化合物库首先从基本结构的分析开始,在本实验室拥有的400,000个小分子化合物库(哈佛大学医学院)中,筛选对eIF2α有激动作用的小分子化合物,再在这些具有基本结构并对eIF2α有激动作用的化合物中,利用计算机辅助药物设计,制作了一个具有25,000个小分子化合物的库。3.小分子化合物的筛选设置阳性对照TG (Thapsigargin毒葫芦卜素),阴性对照DMSO的F/R值设为1,以F/R值大于等于4为阈值,我们从25,000个小分子化合物库中,筛选出50个F/R值大于4的小分子化合物进行后续功能研究。4.DHBDC的化学认定利用western blot,我们发现在这50个化合物中有32个化合物不同程度的促进eIF2α磷酸化。通过对这32个化合物结构的详尽分析和毒理实验后,证明DHBDC生物学作用强大,且对人体的伤害更小。研究证实,DHBDC较其他31个小分子化合物,有着更高的F/R值(F/RDHBDC=85),对eIF2α的磷酸化能力更强,提示DHBDC对eIF2α有更强的激活作用。根据上述实验结果,我们选择DHBDC进行后续功能研究。论文第二部分DHDBC生物学作用及作用机制的研究真核细胞内有四种不同形式的激酶对eIF2α具有激活作用,它们分别是：HRI(haem-regulated inhibitor kinase血红素上调抑制剂激酶)、PERK(PKR-like endoplasmic reticulum kinase蛋白激酶R样内质网激酶)、PKR (Protein kinaseR蛋白激酶R)和GCN2(general control non-derepressible-2GCN2蛋白激酶)。大量的研究证实,体内血红素不足情况下,主要是激活HRI, GCN2主要由营养缺陷途径激活,病毒感染产生的双联RNA重点是激活PKR, ERs条件下以PERK的活化作用为主。实验第一部分中筛选的小分子化合物的功能表型能够有效的激活eIF2α,即可引起eIF2的α亚基磷酸化。本研究试图探讨和分析DHBDC激活eIF2a的细胞内信号转导途径,它在细胞内生物学作用及其作用机制。1.本实验从多个角度和层次证明,DHBDC是PERK和PKR特异性的激活齐。DHBDC通过特异性地活化PERK和PKR,发挥对eIF2α的激活作用。实验没有观察到它对于GCN2和HRI活性的影响。DHBDC和其他31个小分子化合物相比,对eIF2α的激活作用大,特异性更强。结果提示,DHBDC是细胞内PERK和PKR的特异性激活剂。2.DHBDC具有显著的促进肿瘤细胞凋亡的作用。我们的研究表明,敲除PERK和／或PKR后可导致肿瘤细胞凋亡明显减少,提示DHBDC可通过激活PERK和PKR,对肿瘤细胞发挥明显的杀伤作用。3.DHBDC能够促进细胞凋亡过程,诱导蛋白CHOP(C/EBP homologous protein C/EBP同源蛋白)的mRNA和相应蛋白质含量显著水平增加,提示DHBDC可能通过内质网应激途径,促进的凋亡通路的激活,加快细胞死亡进程。4.DHBDC通过抑制cyclin D1/E(细胞周期蛋白Dl/E)的表达,对细胞周期具有明显的抑制作用。5.研究显示,DHBDC可能是通过PERK途径,而不是PKR来激活NF-κB(nuclear factorKB核因子κB)通路活化。6.实验表明,DHBDC具有抑制细胞感染HCV(hepatitis C virus丙型肝炎病毒)病毒的生物学效应。本实验在国内外首次证实,DHBDC是PERK和PKR的双靶向激活剂,它通过激活eIF2α磷酸化途径,明显减少蛋白质合成进而缓解内质网应激的过程；当ERs过程不能及时完成时,又能够通过激活CHOP通路加速细胞的凋亡过程。DHBDC促进肿瘤细胞凋亡作用可能与其诱导CHOP表达和抑制细胞周期效应有关。本研究一方面对于ERs途径、ERs生物学作用和作用机制的研究具有十分重要的理论意义,另一方面DHBDC作为一种潜在的、具有全新作用靶点的抗癌、抗病毒药物,具有重要的推广应用价值。