自身免疫性溶血性贫血（Autoimmune Hemolytic Anemia,AIHA）是一类B淋巴细胞功能亢进,产生并分泌针对红细胞的自身抗体,导致红细胞的寿命缩短、破坏增多的自身免疫性疾病^[1]。若患者体内同时存在血小板的自身抗体,引发免疫性血小板减少症（Immune thrombocytopenia,ITP）,则被称为Evans综合征（Evans syndrome）。B淋巴细胞的功能异常在AIHA的发生过程中起到至关重要的作用,然而其免疫异常及具体致病机制尚不明确。微小RNA（micro RNA,miRNA）是一类长度约为18²2nt非编码小RNA,其可以通过与信使RNA（messenger RNA,mRNA）3’末端的非翻译区（UTR）结合,抑制其翻译过程,在转录后水平调控基因的表达^[2]。机体中约1/3的mRNA翻译过程受到miRNA的调控^[3]。越来越多的证据表明,miRNA对于免疫细胞的分化发育及机体免疫系统的调节起到关键的作用^[4]。既往研究表明,AIHA/Evans综合征患者体内CD5⁺B淋巴细胞数目增多,细胞表面活化分子CD80和CD86的表达水平上调,且胞浆内分泌的细胞因子白介素（Interleukin,IL）10的水平较正常对照明显升高^[5]。AIHA/Evans综合征患者体内CD19⁺B淋巴细胞中,miR-150的表达水平下降,c-Myb基因的表达水平升高,且二者均与患者疾病严重程度（溶血指标,免疫指标）具有明显相关性,推测c-Myb可能为miR-150的作用靶点^[6]。本篇论文在前期研究的基础上,通过质粒构建表达载体及细胞转染的方法,对AIHA/Evans综合征患者及健康对照外周血CD19⁺B淋巴细胞miR-150的表达水平进行调节,采用流式细胞术检测AIHA/Evans综合征患者及健康对照外周血CD19⁺B淋巴细胞在转染前后,CD5⁺B细胞的数目,细胞表面活化分子CD80和CD86的表达水平及胞浆内分泌的细胞因子IL-10的水平;探索miR-150对B淋巴细胞活性和分泌功能的调控机制。同时通过qRT-PCR的方法对转染后miR-150和c-Myb基因的表达水平进行检测,分析两者表达趋势变化,进一步验证c-Myb基因是miR-150的作用靶点。最后通过免疫磁珠法分选AIHA/Evans综合征患者、健康对照组和CLL对照外周血CD19+B淋巴细胞,TRIzol法提取RNA,并通过Small RNA文库构建和BGISEQ-500高通量测序技术对B淋巴细胞miRNA表达谱进行分析,筛选出与健康对照组和CLL对照组比对差异表达的miRNA,为疾病发病机制的后续研究提供思路。故本研究分为三个方面进行:第一部分miR-150对AIHA/Evans综合征患者体内B淋巴细胞活性和分泌功能的调控目的:探究miR-150对AIHA/Evans综合征患者体内B淋巴细胞活性和分泌功能的调控机制方法:选取溶血发作组患者8例,缓解组7例,健康对照组5例。提取外周血单个核细胞,免疫磁珠法分选、纯化各组外周血CD19⁺B淋巴细胞。采用流式细胞术检测患者及健康对照外周血CD19⁺B淋巴细胞转染前CD5⁺B细胞的数目,细胞表面活化分子CD80和CD86的表达水平及胞浆内分泌的细胞因子IL-10的水平。构建miR-150干扰质粒及空白对照质粒,通过lipofectamine 3000脂质体方法进行转染,37℃5%CO₂条件下培养72小时后收集细胞。流式细胞术检测患者及健康对照外周血CD19⁺B淋巴细胞转染后CD5⁺B细胞的数目,细胞表面活化分子CD80和CD86的表达水平及胞浆内细胞因子IL-10的分泌水平。结果:1 AIHA/Evans综合征患者溶血发作组外周血CD5⁺CD19⁺B细胞占CD19⁺B细胞的比例（17.53±10.73%）较缓解组（6.15±2.30%,P<0.05）和健康对照组（7.03±2.14%,P>0.05）明显升高;后两组外周血CD5⁺CD19⁺B细胞占CD19⁺B细胞的比例无统计学差异。2 AIHA/Evans综合征溶血发作组患者外周血CD5⁺CD19⁺B细胞表面CD80的表达水平（29.11±10.97%）高于缓解组（11.34±5.89%,P<0.01）和健康对照组（9.45±9.08%,P<0.05）;后两组CD5⁺B淋巴细胞表面CD80的表达水平无明显统计学差异。AIHA/Evans综合征溶血发作组患者外周血CD5⁺CD19⁺B细胞表面CD86表达水平（32.23±10.64%）高于缓解组（12.3±5.94%,P<0.01）和健康对照组（13.32±7.51%,P<0.01）;缓解组与健康对照组间无明显统计学差异。AIHA/Evans综合征溶血发作组、缓解组及健康对照组外周血CD5^-CD19⁺B细胞表面CD80的表达水平（17.92±8.95%,21.02±10.73%,19.54±6.50%）无统计学差异。AIHA/Evans综合征溶血发作组、缓解组及健康对照组外周血CD5^-CD19⁺B细胞表面CD86的表达水平（21.34±4.24%,15.18±7.40%,22.12±7.86%）无统计学差异。3 AIHA/Evans综合征患者溶血发作组外周血CD5⁺CD19⁺B淋巴细胞内IL-10的表达水平（21.56±3.42%）高于缓解组（8.19±3.66%,P<0.01）和健康对照组（7.54±3.67%,P<0.01）;缓解组及健康对照组间无明显统计学差异。AIHA/Evans综合征溶血发作组、缓解组及健康对照组外周血CD5^-CD19⁺B细胞表面IL-10的表达水平（3.19±1.06%,2.64±1.10%,3.62±0.79%）低于CD5⁺CD19⁺B细胞,且三组之间无统计学差异。4转入hsa-miR-150-5p inhibition干扰质粒后,AIHA/Evans综合征溶血发作组患者外周血CD5⁺CD19⁺B细胞占CD19⁺B细胞的比例（22.21±5.70%）较转染前（17.53±10.73%）升高,但两者间无统计学差异;缓解组外周血CD5⁺CD19⁺B细胞占CD19⁺B细胞的比例（11.66±1.62%）较转染前（6.15±2.30%,P<0.01）升高。健康对照组外周血CD5⁺CD19⁺B细胞占CD19⁺B细胞的比例（13.56±1.27%）较转染前（7.03±2.14%,P<0.01）升高。转染干扰质粒后,AIHA/Evans综合征溶血发作组患者外周血CD5⁺CD19⁺B细胞占CD19⁺B细胞的比例（22.21±5.70%）高于缓解组（11.66±1.62%,P<0.01）和健康对照（13.56±1.27%,P<0.05）,后两组间无明显统计学差异。5转染hsa-miR-150-5p inhibition干扰质粒后,AIHA/Evans综合征溶血发作组、缓解组患者和健康对照外周血CD5⁺CD19⁺B细胞表面CD80的表达水平较转染前无统计学差异。转染后AIHA/Evans综合征溶血发作组患者外周血CD5⁺CD19⁺B细胞表面CD80的表达水平（34.21±8.69%）高于缓解组（10.64±3.05%,P<0.01）和健康对照组（11.73±2.45%,P<0.01）,后两组无明显统计学差异。转染hsa-miR-150-5p inhibition干扰质粒后,AIHA/Evans综合征溶血发作组患者、缓解组和健康对照组外周血CD5⁺CD19⁺B细胞表面CD86的表达水平较转染前无统计学差异。转染干扰质粒后,AIHA/Evans综合征溶血发作组患者外周血CD5⁺CD19⁺B细胞表面CD86的表达水平（27.17±8.72%）高于缓解组（13.11±4.19%,P<0.01）,与健康对照组间无统计差异（16.59±4.43%,P>0.05）转染hsa-miR-150-5p inhibition干扰质粒后,AIHA/Evans综合征溶血发作组、缓解组及健康对照组外周血CD5^-CD19⁺B细胞表面CD80、86的表达水平与转染前比较无统计学差异;且三组之间无统计学差异。6转染hsa-miR-150-5p inhibition干扰质粒后,AIHA/Evans综合征患者溶血发作组、缓解组及健康对照外周血CD5⁺CD19⁺B淋巴细胞内IL-10的表达水平（27.29±5.13%,21.01±4.50%,19.05±3.54%）较转染前升高（21.56±3.42%,8.19±3.66%,7.54±3.67%）,且三组具有统计学差异（P<0.05）。转染干扰质粒后,AIHA/Evans综合征患者溶血发作组CD5⁺CD19⁺B淋巴细胞内IL-10的表达水平高于缓解组（21.01±4.50%,P<0.05）和健康对照组（19.05±3.54%,P<0.05）,后两组无统计学差异。转染干扰质粒后,AIHA/Evans综合征溶血发作组、缓解组及健康对照组外周血CD5^-CD19⁺B细胞内IL-10的表达水平与转染前比较无统计学意义;且低于转染后CD5⁺CD19⁺B细胞内IL-10的表达水平。7转入空白质粒后,AIHA/Evans综合征患者及健康对照外周血CD5⁺CD19⁺B淋巴细胞比例,B淋巴细胞表面活化分子CD80和CD86表达水平及胞浆内IL-10的表达均与转染前无统计学差异。结论:AIHA/Evans综合征患者外周血CD19⁺B淋巴细胞中miR-150的表达水平下降,会导致CD5⁺细胞数目增加,胞浆内IL-10的分泌水平升高。第二部分AIHA/Evans综合征患者B淋巴细胞中c-Myb基因为miR-150作用靶点目的:验证AIHA/Evans综合征患者B淋巴细胞中c-Myb基因为miR-150作用靶点方法:选取溶血发作组患者10例,缓解组13例,健康对照9例。分离外周血单个核细胞、免疫磁珠法分选及纯化各组患者外周血CD19⁺B淋巴细胞。构建hsa-miR-150高表达质粒及干扰质粒,通过lipofectamine 3000脂质体方法进行转染,37℃5%CO₂条件下培养72小时后收集细胞,TRIzol法提取核酸,并通过qRT-PCR对各组转染后miR-150及c-Myb的基因表达水平进行检测。分析两者表达趋势变化情况。结果:1转入hsa-miR-150高表达质粒后,溶血发作组外周血CD19⁺B淋巴细胞miR-150的表达水平（0.64±0.21）较转染前（0.36±0.49）水平升高;缓解组外周血CD19⁺B淋巴细胞miR-150的表达水平（1.63±0.70）较转染前升高（0.76±0.73）,但均无明显统计学差异（P>0.05）;健康对照组外周血CD19⁺B淋巴细胞miR-150的表达水平（2.67±1.55）较转染前升高（1.24±0.73,P<0.05）。转入高表达质粒后,溶血发作组miR-150表达水平（0.64±0.21）低于缓解组（1.63±0.70,P<0.05）和健康对照组（2.67±1.55,P<0.01）,缓解组和健康对照组转染后miR-150表达水平无明显统计学差异。2转入hsa-miR-150干扰质粒后,溶血发作组外周血CD19⁺B淋巴细胞miR-150的表达水平（0.10±0.04）较转染前（0.36±0.49,P<0.05）水平下降;缓解组外周血CD19⁺B淋巴细胞miR-150的表达水平（0.40±0.24）较转染前下降（0.76±0.73）,但无明显统计学差异（P>0.05）;健康对照组外周血CD19⁺B淋巴细胞miR-150的表达水平（0.50±0.16）较转染前下降（1.24±0.73,P<0.05）。转入干扰质粒后,溶血发作组miR-150表达水平（0.10±0.04）低于缓解组（0.40±0.24,P>0.05）及健康对照组（0.50±0.16,P<0.05）,缓解组和健康对照组转染后miR-150表达水平无明显统计学差异。3转入hsa-miR-150高表达质粒后,溶血发作组外周血CD19⁺B淋巴细胞c-Myb基因的表达水平（1.69±0.47）较转染前明显下降（17.65±14.91,P<0.01）;缓解组外周血CD19⁺B淋巴细胞c-Myb基因的表达水平（0.54±0.83）较转染前明显下降（9.23±8.22,P<0.01）;健康对照组外周血CD19⁺B淋巴细胞c-Myb基因的表达水平（0.49±0.44）低于转染前（3.93±6.37,P<0.05）。转入高表达质粒后,溶血发作组,缓解组和健康对照组间c-Myb基因的表达水平无统计学差异。4转入hsa-miR-150干扰质粒后,溶血发作组外周血CD19⁺B淋巴细胞c-Myb基因的表达水平（12.30±2.49）低于转染前（17.65±14.91）,两者间无明显统计学差异;缓解组外周血CD19⁺B淋巴细胞c-Myb基因的表达水平（10.52±2.81）较转染前（9.23±8.22）升高,两者间无明显统计学差异;健康对照组外周血CD19⁺B淋巴细胞c-Myb基因的表达水平（7.52±1.16）较转染前（3.93±6.37,P<0.05）升高。转入干扰质粒后,溶血发作组外周血CD19⁺B淋巴细胞c-Myb基因的表达水平（12.3±2.49）高于健康对照组（7.52±1.16,P<0.05）,溶血发作组与缓解组,缓解组与健康对照组间c-Myb基因表达水平无明显统计学差异。5在转染hsa-miR-150高表达质粒及干扰质粒后,溶血发作组、缓解组及健康对照组外周血CD19⁺B淋巴细胞c-Myb基因mRNA的表达水平与miR-150的表达水平呈负相关（r=-0.8788,P<0.01;r=-0.6206,P=0.0136;r=-0.6606,P=0.0194）。结论:在B淋巴细胞中c-Myb基因为miR-150作用靶点,AIHA/Evans综合征患者体内B淋巴细胞miR-150表达水平下调导致c-Myb基因表达水平升高,可能参与疾病的发生发展。第三部分AIHA/Evans综合征患者B淋巴细胞miRNA表达谱的分析目的:对AIHA/Evans综合征患者外周血CD19⁺B淋巴细胞miRNA表达谱进行分析。方法:选取AIHA/Evans综合征患者4例,同期健康对照组4例,CLL对照4例。分离外周血单个核细胞,免疫磁珠法分选及纯化各组外周血CD19⁺B淋巴细胞。TRIzol法提取RNA,并通过Small RNA文库构建和BGISEQ-500高通量测序技术对B淋巴细胞miRNA表达谱进行分析,分别筛选出与健康对照组和CLL对照组比对差异表达的miRNA。结果:与健康对照组比较,AIHA/Evans组RNA样本中,有178个miRNA表达上调,143个miRNA表达下调,差异表达基因FDR≤0.001具有统计学差异。与CLL组比较,AIHA/Evans组RNA样本中,有148个miRNA表达上调,186个miRNA表达下调,差异表达基因FDR≤0.001具有统计学差异。结论:AIHA/Evans综合征患者外周血CD19⁺B淋巴细胞miRNA表达谱与健康对照组和CLL组比较有较大差异,miRNA表达谱及差异表达分析结果为疾病发病机制的后续研究探讨提供思路。