干细胞是一类具有自我更新和多向分化能力的细胞的总称。利用载体将四个转录因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)转入已分化的体细胞内,可使其重编程为类似于ESCs性质的细胞,被称为诱导多能干细胞(iPSC)。应用不同的细胞因子可将iPSCs定向分化成为不同类型的细胞。直接将患者来源的体细胞重编程为iPSCs,可获得患者特异性诱导多能干细胞系。通过定向分化为疾病相关的细胞类型,可再现疾病的发生过程,为研究疾病的发病机制及药物筛选提供了良好的疾病细胞模型。目前,iPSCs已广泛应用于遗传病模型的建立。肌阵挛伴破碎红纤维综合症(MERRF)是一类由线粒体突变所致的遗传病。其致病位点多数为线粒体DNA第8344位(m.A8344G)点突变,但目前对出生患儿无任何有效治疗方法,同时也缺乏良好的疾病模型进行机制研究。因此,本研究分为两部分内容,分别为建立诱导多能干细胞平台和应用iPS技术建立线粒体遗传病MERRF疾病模型的初步研究。第一部分建立由外周血单个核细胞、羊水细胞重编程为诱导多能干细胞的平台目的用非整合重编程技术构建人外周血单个核细胞(PBMCs)和羊水细胞(AFCs)来源的诱导多能干细胞(iPSCs)。方法收集健康志愿者外周血及AFCs标本,从外周血细胞中分离出PBMCs,用含4个重编程转录因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)的仙台病毒感染PBMCs及AFCs,并使用无饲养层细胞的培养体系(feeder-free)培养并获得可稳定传代的iPS细胞系。通过细胞形态学、碱性磷酸酶(AKP)染色、免疫荧光染色、拟胚体(EB)形成及分化试验、RT-PCR等对iPSCs进行多能性的鉴定;用核型分析和检测仙台病毒基因组RNA验证iPSCs的完整性和安全性。结果应用仙台病毒感染PBMCs和AFCs的第16 d,显微镜下可见克隆样细胞团。分别挑选形态较好的24个PBMCs来源的克隆和23个AFCs来源的克隆进行传代,最后分别得到可稳定传代培养的3个PBMC-iPS细胞系和3个AFC-iPS细胞系。完整性和安全性验证试验证明iPSCs核型均正常,外源性病毒基因组RNA在传代过程中不断被清除,第20代时已无法检测到仙台病毒基因组存在,证明外源性病毒基因组可以完全被清除。对这6个细胞系进行多能性验证,证明6个细胞系均具有多能性。结论建立了由PBMCs和AFCs非整合重编程的诱导体系和无饲养层细胞的培养体系,并获得了具有多能性、核型正常且不含外源基因的PBMC-iPSCs和AFC-iPSCS。第二部分应用iPSCs建立线粒体遗传病MERRF疾病模型的初步研究目的构建阵挛性癫痫伴破碎红纤维综合症(MERRF)患者来源的诱导多能干细胞(iPSCs),并对应用iPSCs建立MERRF疾病模型进行初步探索。方法采集MERRF患者外周血及胎儿AFCs,分离外周血内PBMCs,用含有4个重编程转录因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)的仙台病毒感染PBMCs和AFCs,获得患者来源的iPSCs;通过细胞形态学、碱性磷酸酶(AKP)染色、免疫荧光染色、拟胚体(EB)形成和分化试验、RT-PCR和畸胎瘤试验对细胞多能性进行鉴定,通过分析染色体核型对iPSCs完整性进行鉴定。通过焦磷酸测序检测原代细胞及成功建系的iPSCs中mtDNA第8344位的突变比例。再通过ATP合成实验检测在突变比例不同的细胞系中,ATP合成量是否存在差异。最后将iPSCs定向分化为心肌细胞,使用心肌特异性抗体进行免疫荧光染色,鉴定分化的细胞类型为心肌细胞,并通过心肌细胞搏动频率初步探索高突变率的心肌细胞是否存在功能异常。结果建立了 6个患者PBMCs来源的iPS细胞系,2个AFCs来源的iPS细胞系。染色体核型分析表明iPSCs核型正常。经过多能性试验证明其多能性。通过焦磷酸测序检测原代PBMCs mtDNA 8344位点突变比例为70.67%,原代AFCs mtDNA位点突变比例为69.96%。建立的6个PBMC-iPS细胞系中,mtDNA 8344位点的突变比例分别为 68.24%、60.51%、45.95%、24.06%、62.11%和 0%。建立的2个AFC-iPS细胞系中,mtDNA 8344位点的突变比例均为0%。通过ATP合成量检测试验发现PBMCs来源的iPS细胞系中,突变比例为零的细胞系ATP合成量为94 μmol/gprot,突变比例最高的细胞系ATP合成量为66 μmol/gprot。通过将iPSCs定向分化为心肌细胞,发现分化前后细胞的突变比例无明显差异。通过统计心肌细胞搏动频率,发现心肌细胞搏动频率随突变比例增加而降低。结论成功构建了 MERRF患者来源的iPS细胞系。重编程后线粒体的突变比例并不稳定,应用大量挑选克隆的方法可得到与原代细胞突变比例相似的细胞系。对突变比例不同的细胞系进行ATP合成量检测,发现突变比例高的细胞系ATP合成量降低,说明所得的iPS细胞系能够重现患者原代细胞的能量代谢缺陷。定向分化的心肌细胞突变比例与分化前无明显差异,说明心肌分化过程不会影响突变比例。通过对心肌细胞搏动频率统计,我们发现携带高突变比例的心肌细胞搏动能力降低。这些结果表明我们通过重编程技术成功建立了 MERRF综合症的iPS细胞模型。