论文部分内容阅读
奶牛乳腺炎是奶牛产后常见疾病之一,可造成巨大的经济损失。病原菌入侵乳腺组织并在宿主细胞中生存,这一过程常伴随组织损伤。金黄色葡萄球菌(S.qaureus)是奶牛乳腺炎重要的致病菌之一。乳腺被感染损伤后,在各种信号通路和因子的作用下进行自我修复,以恢复乳腺的正常结构和功能。硒通常以硒蛋白的形式存在于动物机体内。已有多项研究证实,硒能够调控细胞的增殖,但运用硒对于奶牛乳腺上皮细胞(Bovine mammary epithelial cells,BMECs)的促增殖作用尚未见报道。本试验通过体外培养BMECs,研究Wnt/β-catenin和PI3K/Akt/mTOR信号通路、细胞周期以及修复相关因子,探讨硒对BMECs增殖的作用机制,为奶牛乳腺炎的防治提供理论依据。(1)为了研究硒对S.aureus感染BMECs增殖的影响采用流式细胞术检测细胞周期,分组同上。结果显示:硒添加后,与空白组相比,4μM硒添加,S期细胞极显著增多(p<0.01);8μM硒使G0/G1期的细胞极显著减少(p<0.01),G2/M期细胞极显著增多(p<0.01),PI极显著升高(P<0.01)。当S.aureus感染细胞后,与空白组相比,S.aureus组S期细胞极显著下降(p<0.01),G2/M期细胞显著增多(p<0.05)。与S.aureus组相比,2、4、8 μM硒与S.aureus共处理时,G0/G1期细胞显著或极显著下降(p<0.05或p<0.01),S期细胞显著或极显著增多(p<0.05或p<0.01),PI显著上升(p<0.05)。说明硒可以调控BMECs的细胞周期。当S.aureus感染BMECs时会阻滞BMECs细胞周期,而适当浓度的硒促进BMECs向S期和或G2/M期的转化,PI显著升高。(2)为研究硒对BMECs相关修复基因表达的影响,检测CTGF、EGFR、VEGF、TGF-β、ERα和ERβ基因的mRNA表达。结果显示:硒添加后,与空白组相比,2 μM硒促进BMECs中CTGF和VEGF基因表达水平升高,差异显著(p<0.05);4 μM硒促进BMECs中CTGF、EGFR、TGF-β3、VEGF、ERα和ERβ基因表达水平上升,差异显著或极显著(p<0.05或p<0.01);8μM 硒促进 BMECs 中 CTGF、EGFR、TGF-β3、VEGF、ERα 和 ERβ 基因表达水平极显著上升(p<0.01)。S.aureus感染细胞后,与空白组相比,S.aureus组CTGF、EGFR、VEGF、ERα、ERβ和TGF-β3基因表达上升,差异显著或极显著(p<0.05或p<0.01)。与S aureus组相比,2 μM 硒与 S.aureus 共处理组 EGFR、TGF-β3、VEGF 和ERβ基因表达上升,差异极显著(p<0.01);4 μM硒与S.aureus共处理组VEGF、CTGF、EGFR和ERα基因表达水平升高,差异显著或极显著(p<0.05或p<0.01);8μM硒与S.aureus共处理组EGFR、CTGF、VEGF和ERα基因表达水平升高,差异显著或极显著p<0.05或p<0.01)。说明硒可以调节BMECs中修复相关因子和受体的基因表达。当S.aureus感染BMECs,适当浓度的硒通过促进上述修复因子和受体基因的表达,影响组织和细胞的增殖和修复。(3)研究硒调控 Wnt/β-catenin 和 P13K/Akt/mTOR 信号通路在 S.aureus 感染BMECs过程中的作用机制。本试验以BMECs为研究对象,设置空白组、S.aureus组(MOI=1:1)、亚硒酸钠组(2、4、8 μM),以及亚硒酸钠与S.aureus共处理组。运用Western Blot对Wnt/β-catenin 信号通路中的关键蛋白 β-catenin、Cyclin D1、c-Myc 以及 PI3K/Akt/mTOR 信号通路中PI3K和AKT的磷酸化水平进行检测,通过免疫荧光检测β-catenin蛋白的分布情况,探究硒对 BMECs和S.aureus感染 BMECs 情况下 Wnt/β-catenin 和 PI3K/Akt/mTOR 信号通路的影响。结果显示:硒添加后,与空白组相比,4μM硒促进BMECs中Cyclin D1蛋白表达升高,差异极显著(p<0.01);8μM硒促进BMECs中β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表达升高,差异显著或极显著(p<0.05或p<0.01),β-catenin入核增加。2μM硒促进BMECs中mTOR蛋白磷酸化水平升高,差异显著(P<0.05);4和8μM硒促进BMECs中PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化水平升高,差异显著或极显著(p<0.05或p<0.01)。当S.aureus感染BMECs时,与空白组相比,β-catenin蛋白表达升高,差异极显著(p<0.01),β-catenin入核增加;PI3K蛋白和Akt蛋白磷酸化水平升高,差异极显著(p<0.01)。与S.aureus 组相比,2、4 和 8 μM 硒添加,促进了S.aureus感染的 BMECs 中 β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表达升高,其差异显著或极显著p<0.05或p<0.01),β-catenin入核增加;2μM硒与S.aureus共处理组mTOR蛋白磷酸化水平升高,差异显著(p<0.05);4μM硒与S.aureus共处理组PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化水平升高,差异显著或极显著(p<0.05 或 p<0.01)。说明硒可以促进 BMECs 中 Wnt/β-catenin 和 PI3K/Akt/mTOR 信号通路的激活。当S.aureus感染BMECs,适当浓度的硒可以促进BMECs中Wnt/β-catenin和PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活。综上所述,硒通过激活Wnt/β-catenint通路和PI3K/Akt/mTOR通路,调控相关修复因子和受体的表达,改善BMECs的细胞周期,促进了 BMECs的增殖和修复。研究结果为探究奶牛乳腺损伤的自我修复和乳腺炎的防治提供理论基础。