背景心力衰竭是由于心脏器质性或者功能性疾病损害心脏充盈和射血能力而引起的一组临床综合征。心力衰竭的主要临床表现有引起运动耐量受限的呼吸困难和疲乏,以及导致肺脏充血和肢体水肿的液体潴留。心力衰竭这一临床综合征可由于心包、心肌、心内膜或者大血管疾病所致,但是大多数患者有左心室功能受损的症状。冠状动脉疾病仍是心力衰竭的主要原因。心力衰竭是一个严重的公共卫生问题,中国心力衰竭患病率达0.9%,住院率占同期心血管疾病的20%。美国有超过500万患者,每年有近50万新诊断的心力衰竭患者。心力衰竭主要是老年人的疾病,中国65岁老年人群中大约13%患有心力衰竭。美国每年花费在心力衰竭上的费用约为37亿美元。洋地黄药物作为治疗心力衰竭的正性肌力药物,应用于临床已有200多年历史,对其作用机制的现代研究证实该类药物通过抑制Na⁺-K⁺-ATP酶活性而发挥正性肌力作用。近年来研究发现洋地黄类药物在细胞水平表现了多靶位的作用机制。在不影响Na⁺-K⁺-ATP酶活性的情况下,可以直接作用于肌浆网上的兰尼碱受体,促进Ca²⁺释放,产生正性肌力作用。洋地黄类药物和Na⁺-K⁺-ATP酶结合的同时,还可以发挥信号传导功能,低剂量时激活了T型Ca²⁺通道,提高了心肌收缩力,促进了细胞增殖。而高剂量则可以通过抑止核转录因子促进细胞凋亡,反映了该类药物有双重作用。洋地黄可抑制心衰中神经内分泌的过度激活,增强副交感神经活性,是其用于心衰治疗的重要机制之一。近期的DIG实验证实地高辛在低浓度下能够降低心力衰竭患者的住院率和死亡率,可以节省大量的医疗费用。但是治疗量与中毒量30%的重叠这一严重制约了其在临床广泛应用的重大难题,但迄今尚无可以替代该类药物的新型高效低毒的强心药物。2000年6月人类基因组框架图的完成,标志着生命科学的研究进入一个新纪元—后基因组时代,蛋白质组学即成为这一前沿研究领域的核心技术。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础,也能为多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组比较分析,可以找到某些疾病特异性的蛋白质分子,它们可成为新药物设计的分子靶点,或者也会为疾病的早期诊断提供分子标志。人类疾病的蛋白质组研究通常采用比较蛋白质组学分析,同位素标记相对和绝对定量技术（isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ）是其中重要的研究方法之一。iTRAQ是一种新的、功能强大的可同时对四种及以上样品进行绝对和相对定量研究的方法。iTRAQ试剂为可与氨基酸N端及赖氨酸侧链连接的胺标记同重元素。在质谱图中,任何一种iTRAQ试剂标记的不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。而在串联质谱中,信号离子表现为不同质荷比的峰值,因此根据波峰的高度及面积,可以得到蛋白质的定量信息。目前国际国内心血管疾病等重大疾病已进行了富有成效的研究。蛋白质组学技术日趋完善与成熟,因而,借助于先进的分子生物学手段,研究地高辛对心肌细胞的作用,深入探讨地高辛在细胞水平生物学作用机制,寻找其作用靶蛋白和靶位相关蛋白,对于拓宽临床对洋地黄药物的作用机制的认识,进一步明确慢性心力衰竭等重要心血管疾病的病理生理机制,寻找药物治疗的新靶位,开辟新的心血管疾病治疗途径具有重要的理论和实际意义。目的采用蛋白质组学方法寻找地高辛对心力衰竭大鼠心肌细胞作用的差异蛋白,阐述地高辛治疗慢性心力衰竭的作用机制,进一步确定其正性肌力作用的靶位蛋白或相关蛋白,为开辟心血管疾病治疗的新途径奠定理论基础。方法1心力衰竭大鼠动物模型的建立采用Johns方法结扎大鼠冠状动脉前降支,造成急性心肌梗死后形成慢性心力衰竭动物模型。健康雄性Wistar大鼠50只,取35只行手术造成急性心肌梗死,15只作为假手术组。建立心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠动物模型,分为心力衰竭对照组、地高辛治疗组。超声心动图动态检测心肌梗死后大鼠心脏结构和心功能的改变。测定左心室舒张末期及收缩末期内径（LVIDd,LVIDs）、左心室舒张末期及收缩末期后壁厚度（LVPWd,LVPWs）。计算左心室射血分数（LVEF）及左心室短轴缩短分数（FS）,记录二尖瓣瓣口舒张早期最大血流峰值速度（E）,舒张晚期最大血流峰值速度（A）和收缩期应变率峰值（SRs）。分别记录冠状动脉手术前、手术8周和手术16周后的体重、收缩压（SBP）心电图的变化。观察病理结构和电镜超微结构的改变。2地高辛对心肌细胞的差异蛋白质筛选分别选取假手术组、对照组和治疗组大鼠的心肌细胞,提取心肌细胞总蛋白。每组选取6个标本研磨成粉末,裂解、离心和bradford法定量分析,进行蛋白质分离,将蛋白质裂解为肽段,然后用iTRAQ试剂进行差异标记,将标记的样本相混合。选取3种iTKAQ 8plex kit试剂115、117和119进行标记,假手术组样品用115、对照组用117、治疗组用119标记。与样本结合后,用MALDI-TOF/TOF检测每个组分中的肽段组成情况,对于肽段含量较少的组分合并。3蛋白质谱鉴定电喷雾四极杆飞行时间串联质谱仪micro-QTOF对肽段进行鉴定分析。分别用DATA ANALYSIS 4.0和WARP-LC软件分析质谱数据。根据搜索结果中每个蛋白匹配肽段出现次数为1次,Rank为1的肽段用于该蛋白的定量。DATAANALYSIS 4.0提取选定肽段的对应iTRAQ标记物的峰面积。115、119的峰面积分别与117的峰面积比较,求取比值。结果1大鼠心肌梗死后8周,心室结构发生变化,表现为心腔显著扩大,室壁变薄。心脏运动幅度明显减弱,收缩和舒张功能下降。心功能检测结果:治疗前对照组、治疗组大鼠较假手术组LVEF、FS和SRs明显减低;E和E/A明显增高,A值减低。治疗后治疗组大鼠LVEF、FS高于对照组,SRs升高明显;E减低,A值升高,E/A减低。治疗后对照组和治疗组心律失常发生率无差异,未观察到药物中毒心电图改变。相关性分析:三组治疗前后的LVEF与SRs成正相关,FS与SRs成正相关,所有动物治疗前后的LVEF和FS与SRs均成明显正相关。治疗8周后光镜下观察假手术组大鼠肌纤维大小近似,排列规整。对照组心肌纤维排列不规则,组细胞肿胀明显,部分心肌纤维断裂,细胞间纤维组织增生明显。治疗组心肌纤维排列不规整,纤维组织增生,心肌细胞微肿胀。电镜超微观察假手术组心肌细胞膜外基板完整,肌原纤维排列规则,肌节长短一致,线粒体结构和分布基本正常,少量肌浆网肿胀。对照组肌节长短基本一致,Z线结构和肌原纤维破坏,线粒体大小不一并灶性聚集,可见线粒体空化,肌浆网肿胀。治疗组心组心肌细胞肌节长短基本一致,部分Z线结构和肌原纤维破坏,大多数线粒体和肌浆网结构基本正常,但线粒体增生明显,数量多,肌浆网肿胀。2电喷雾四极杆飞行时间串联质谱仪micro-QTOF鉴定分析,发现主要有32个差异蛋白点,其中二个或以上肽段鉴定蛋白13个,单个肽段鉴定蛋白19个。分别用DATA ANALYSIS 4.0和WARP-LC软件分析质谱数据,MASCCOT搜索质谱匹配蛋白标本差异表达蛋白点,鉴定的32个蛋白,其中治疗组较对照组18个蛋白上调,14个下调;对照组较假手术组有13个蛋白上调,17个蛋白下调,2个变化不明显。质谱鉴定得出32个差异蛋白包括线粒体蛋白、肌原纤维相关蛋白、胞浆蛋白、核蛋白和肌浆网蛋白等,其中以线粒体蛋白为主占53%,其次是肌原纤维相关蛋白占25%。鉴定的32个差异蛋白进行功能分析。在鉴定的32个蛋白质中,涉及能量代谢、细胞收缩、信号转导等,所占比例分别为50%、25%、13%。结论1心肌梗死后大鼠模型是研究慢性心力衰竭机制的有效手段。地高辛可以改善慢性心力衰竭大鼠左心室收缩和舒张功能。超声应变率技术可以用来评价心力衰竭的收缩功能。地高辛作用的差异蛋白分布于线粒体和肌原纤维等,涉及能量代谢、细胞收缩、信号转导等:以调节Ca²⁺浓度变化的正性肌力作用依旧是改善心功能的基础,其中annexinⅥ可能在心肌细胞收缩和舒张功能中发挥重要的作用。另外,优化心肌能量代谢也可能是地高辛是改善心功能的主要因素之一。3本实验提供了地高辛对心力衰竭心肌细胞作用蛋白质表达的重要信息,为全面阐述该药物作用分子机理提供了重要方法和新线索,为寻找新的心血管疾病治疗途径提供了有意义的靶位蛋白,为探讨心血管疾病新的防治措施奠定了初步依据。