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普通变形杆菌(Proteus vulgaris)广泛存在于自然环境中的一种革兰氏阴性菌。普通变形杆菌除分布于自然环境外,还存在于人和野生动物及家畜的肠道中,在一定条件下能够引起人和动物的感染,引发尿道感染、菌血症、中枢神经系统疾病、伤口感染、风湿关节炎及相关疾病等。近年来,有很多关于虾、中华鳖、石斑鱼等因普通变形杆菌感染并发病致死的报道。目前关于变形杆菌属细菌的致病性研究主要集中在奇异变形杆菌和其尿路感染上,而与普通变形杆菌相关的研究较少,针对珍稀动物扬子鳄的普通变形杆菌感染研究更是鲜见。本实验室曾多次在发病的扬子鳄及扬子鳄卵上分离到普通变形杆菌,发病扬子鳄食欲不振,四肢关节肿胀,经过病理解剖可观察到严重肾脏损伤,肾脏、四肢关节的尿酸盐沉积。由于变形杆菌是一种常见的泌尿道感染(UTI)细菌,且有研究证明其能引起风湿性疾病,泌尿道脏器损伤又会影响尿酸盐的正常排出,所以为探究普通变形杆菌与扬子鳄发病的之间关系,本研究拟对扬子鳄源普通变形杆菌进行毒力因子的研究。研究结果对防控扬子鳄普通变形杆菌感染、扬子鳄的健康人工养殖,对扬子鳄的物种保护有重要意义。2012-2013年间,本实验室从安徽宣城扬子鳄繁殖研究中心发病扬子鳄或死亡身上分离的普通变形杆菌17株,保存备用。本研究对保存的菌株进行了毒力检测、变形杆菌常见毒力因子检测,得到了其中8株致病菌株的LD50,以及17株菌FliL、ZapA、HlyA、HpmA、HpmB、RopA基因的携带结果,其中FliL的检出率最高(17/17,100%),其他几种基因分别是 ZapA(9/17,52.9%),HlyA(0/17,0),HpmA(4/17,23.5%),HpmB(3/17,17.6%),RopA(10/17,58.8%)。试验结果表明扬子鳄源变形杆菌毒力与单个的毒力因子和不同的毒力因子组合没有显明的线性关系。但经由试验检测,找到了 17株菌株含有共同的与鞭毛相关的毒力因子FliL。FliL是Ⅱ类鞭毛操纵子中的主要基因,鞭毛与细菌的致病性直接相关。选取其中一株强毒株作为对象,对细菌进行FliL基因敲除,进一步探究。利用Red重组系统,首先以带有Kan抗性的pKD4质粒作为模板,构建FliL打靶片段。将带有Amp抗性pKD46质粒电转入普通变形杆菌XX2,获得重组菌XX2/pKD46。经由L-阿拉伯糖的诱导制备XX2/pKD46感受态细胞,并将打靶片段转入XX2/pKD46感受态细胞。在Red重组系统的作用下,细菌的基因和打靶片段进行重组,形成带有Kan抗性的XX2△FliL::Kan。再通过将pCP20质粒导入XX2△FliL::Kan,利用FLP酶去除XX2△FliL::Kan上的抗性基因,通过42℃培养去除温敏性pCD20质粒,得到缺失菌株XX2△FliL。通过构建互补质粒,再电转入XX2△FliL感受态细胞,构建缺失互补株XX2△FliL/P FliL。FliL野生株、缺失株和互补株的生长速度在前6 h没有明显区别,6 h后野生株相比FilL缺失株、Fi1L缺失株相比FilL互补株生长速率要快。为探究鞭毛FilL基因对扬子鳄源普通变形杆菌毒力的影响,对野生株、缺失株的运动性能和群游性能、毒力进行了比较分析。结果表明,FliL对普通变形杆菌群游必不可少,但对运动不起作用。对小鼠的致病力,缺失株与野生株的LD50相差约100倍,表明鞭毛影响普通变形杆菌毒力。研究结果为进一步探究普通变形杆菌与扬子鳄发病出现肾脏、四肢关节尿酸盐沉积症状进而导致死亡的原因,及治疗奠定基础。