由于血脑屏障的存在,在一段时间内,中枢神经系统被认为是免疫豁免器官,但是越来越多的研究发现,脑组织在一定条件下是可以发生免疫应答的。在病理条件下,由于血脑屏障通透性发生改变,中枢神经系统可以有T细胞、NK细胞、巨噬细胞的浸润从而发生免疫应答。相比肿瘤细胞的免疫逃逸和耐受,中枢神经系统的免疫应答作用是微乎其微的,因此,如何增强中枢神经系统对肿瘤细胞的免疫应答,特别是如何将免疫杀伤细胞向脑组织病灶大量定向募集成为了众学者的研究热点。已经有报道证实淋巴细胞体内被激活后,可穿透血脑屏障,因此研究者们可以通过靶向免疫治疗脑胶质瘤,使之成为抗肿瘤治疗的辅助治疗之一。自从脑胶质瘤特异性标志抗原被发现及鉴定后,以及体外培育技术的不断提高,采用特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)针对脑胶质瘤进行过继治疗,是生物治疗研究领域目前最令人期待的之一。有报道指IL-33不仅可以通过其特定受体ST2介导TH2型免疫反应,也可以通过相关机制直接作用于NK、DC、CTL等免疫细胞,不但能促进免疫细胞对肿瘤细胞的直接杀伤,也能促进其释放相关细胞因子间接杀死肿瘤细胞,起到免疫放大作用。无论是对于天然免疫还是获得性免疫,IL-33都起着至关重要的作用。无论是感染性、自身免疫性疾病,还是肿瘤性疾病,IL-33都具有很强的研究价值。关于IL-33与肿瘤的关系,目前在非中枢神经系统肿瘤方面的研究己取得新进展。IL-33少量表达于中枢神经系统的某些细胞中,在正常细胞中是以核因子的形式存在,只有当细胞坏死崩解之后,才会被释放到细胞外。如何在中枢神经系统中使IL-33具有一定的有效浓度是本实验首先要解决的问题。通过质粒和慢病毒为载体转染胶质瘤细胞系GL261,研究IL-33能否在GL261中表达并持续高表达,是所有试验能否顺利进行的关键。将能稳定过表达IL-33的GL261细胞注入体内, NK等免疫细胞发挥免疫杀伤作用,GL261细胞坏死崩解并释放出大量的IL-33,这时我们就可以利用IL-33的免疫放大作用,调动体内DC、NK、CTL等免疫细胞发挥肿瘤抗原提呈和免疫杀伤作用,从而在脑胶质瘤的发生、发展阶段杀死肿瘤细胞,抑制胶质瘤的生长。为了深入研究过表达IL-33对脑胶质瘤生长抑制的作用机制,我们在本实验中也引入了CTL的过继治疗。为了明确IL-33是否存在普遍的抗肿瘤现象,我们在体内试验部分利用稳定转染了IL-33的B16-F10建立黑色素瘤载瘤模型,作为对照组。这些新的发现及研究将为脑胶质瘤特别是高级别脑胶质瘤的治疗提供新的方向,为其临床应用提供坚实的理论基础。第一章鼠IL-33质粒的构建及其在GL261中过表达的初步研究目的构建鼠IL-33质粒并探讨其在小鼠多形性胶质母细胞瘤细胞系GL261中过表达的可行性。方法从Genebank找出鼠IL-33基因全长序列,通过人工合成,装载于表达载体pEZ-M03,大量扩增后酶切鉴定。将鉴定正确的质粒利用LipofectamineTM LTX转染试剂转染GL261,采用实时定量PCR和RT-PCR检测目的基因的表达量；ELISA法检测目的蛋白的表达量。结果成功构建了鼠IL-33真核质粒pEZ-M03-mIL33,经脂质体转染试剂成功转染GL261。经荧光检测,转染后48小时转染效率最高。实时定量PCR, RT-PCR检测,目的基因高表达。ELISA法检测到转染细胞株中目的蛋白明显高表达。结论成功构建的鼠IL-33真核质粒在GL261中获得高表达,为进一步慢病毒建立稳定转染细胞系和后期的功能性研究打下基础。第二章稳定表达鼠IL-33的GL261细胞株的建立及体外功能研究目的利用成功包被目的基因的慢病毒颗粒为载体,建立稳定高表达鼠IL-33的GL261细胞株,并行体外功能研究,为进一步体内研究奠定基础。方法利用包被鼠IL-33基因的慢病毒颗粒转染GL261,在含嘌呤霉素的完全培养基的筛选下,大量扩增阳性克隆,并观察转染后的GL261细胞体外生长状况。通过实时定量PCR和RT-PCR检测目的基因的表达量；Western-blot法及ELISA法检测目的蛋白的表达量,Transwell侵袭实验检测其侵袭性。结果慢病毒颗粒成功转染GL261,在含浓度为6μg/ml的嘌呤霉素完全培养基的筛选出阳性克隆。大量扩增阳性克隆,通过实时定量PCR、RT-PCR、Western blot法及ELISA法检测到稳定转染细胞株中目的基因和蛋白明显高表达。转染后GL261细胞生长状态和侵袭性不受影响。结论成功利用包被目的基因的慢病毒颗粒感染GL261,建立了稳定过表达鼠IL-33的GL261细胞株,并且其生长状态和侵袭性均不受影响,为进一步体内研究打下了基础。第三章过表达鼠IL-33对鼠脑胶质瘤生长抑制作用的体内研究目的通过建立小鼠脑胶质瘤模型,观察正常和不同免疫细胞缺陷的小鼠颅内肿瘤生长情况。联合CTL过继治疗,探讨IL-33抑制脑胶质瘤生长的免疫机制。方法立体定向仪指引下,选取SPF级别C57、Balb/c-NU、 NOD/SCID鼠为载瘤动物建立脑胶质瘤模型。其中C57同种群小鼠间,以ASGM1封闭NK与否划分为两类。分别以IL-33阳性和阴性克隆GL261及空载GL261细胞建立模型, NK封闭IL-33阳性克隆组联合CTL免疫过继治疗。流式细胞术检测小鼠NK细胞封闭效果；7.0T磁共振法动态观测小鼠颅内成瘤情况。取出脑组织行石蜡切片,HE染色法检测成瘤情况；免疫组化法检测脑组织中IL-33的分布；免疫荧光法观测组织中CD8、CD31表达情况。以小鼠黑色素瘤瘤细胞系B16-F10作为对照组,按照与GL261相同的分组方法建立皮下成瘤模型,并动态观察成瘤情况。结果成功建立了各种小鼠脑胶质瘤瘤模型,流式细胞检测证实ASGM1能够有效抑制C57体内NK活性,在免疫力正常的C57小鼠中IL-33阳性克隆组磁共振及HE切片均未发现有肿瘤生长,而剩余的各类小鼠均有肿瘤生长。免疫组化证实了IL-33在接种小鼠脑组织内有大量表达。免疫荧光证实了接种了IL-33阳性克隆细胞的小鼠脑组织中CD8高表达。成功建立了各类小鼠皮下黑色素瘤模型,通过对比各组小鼠皮下肿瘤生长速度,证实转染了IL-33的B16-F10在正常C57小鼠中的生长速度慢于其他组。结论成功建立了各类小鼠脑胶质瘤模型,证实了IL-33的过表达对鼠脑胶质瘤的生长具有抑制作用。成功建立了各类小鼠黑色素瘤皮下模型,观察到IL-33对于小鼠黑色素瘤也具有生长抑制作用。在其作用媒介NK细胞存在的前提下,IL-33通过其受体直接或间接作用于各类免疫细胞,刺激机体CTL的大量扩增和定向浸润,发挥免疫放大作用,从而产生强大的抑制肿瘤生长作用。