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程序性细胞死亡受体1 (programmed cell death 1, PD1),是属于CD28/CTLA-4家族的一种免疫受体分子,通过与其配体PD-L1或PD-L2相互作用,该分子可下调T细胞受体和B细胞受体介导的信号通路。PD1/PD-L由的生理意义涉及到免疫应答的各个方面,包括自身免疫、肿瘤免疫、感染免疫、抑制免疫、变态反应和免疫自稳等。之前,其他课题组已经发现了4种可诱导表达的PD1剪接异构体,然而这些异构体的功能却不是很清楚。弄清楚这些PD1异构体的功能是研究PD1免疫调节功能的关键环节,且有利于为疾病治疗和疫苗开发提供新的思路。最近,我们发现了PD1的一种新型剪接异构体,并将其命名为A42PD1。与PD1不同,Δ42PD1不能结合PD-L1和PD-L2,也不被常用的几株商业化PD1特异性单克隆抗体所识别。可溶性A42PD1 (sA42PD1)重组蛋白可在体外诱导PBMCs分泌前炎性细胞因子,在体内增强CD8+ T细胞免疫反应,表明Δ42PD1是一种功能性免疫调节分子。特异性识别Δ42PD1而不识别PD1的单克隆抗体,是进一步研究这一新发现的免疫分子生理功能的关键。本研究旨在制备鼠抗人Δ42PD1单克隆抗体,以便于对该新发现免疫分子的功能进行研究。为了便于抗体的筛选,我们首先通过稳定转染的方法分别构建了稳定表达人PD1和Δ42PD1的293T细胞系,通过有限稀释法获得单克隆细胞并分别命名为293T-PDl和293T-Δ42PD1,目的基因的表达通过流式细胞仪、Western blot和RT-PCR的方法得以证实。免疫原的制备,我们采用293F真核表达体系表达重组蛋白sΔ42PD1Fc(由人sΔ42PD1与兔IgG1 Fc段融合而成),通过重组proteinG来纯化免疫原。采用DNA初次免疫/蛋白质加强免疫的策略,先后用sΔ42PD1Fc重组质粒和重组蛋白免疫BALB/c小鼠。流式细胞术分析免疫小鼠血清分别与293T-PD1和293T-A42PD1结合情况,结果发现免疫血清与293T-A42PD1的结合显著性高于与293T-PDl的结合,表明PDl和A42PD1分子间存在免疫原性的巨大差异。最后一次免疫后,处死免疫小鼠,取脾细胞,通过传统单克隆抗体制备的方式与SP2/0细胞进行融合。通过间接ELISA的方法筛选出两株分泌抗人A42PD1单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别被命名为CH34和CH101。流式细胞术的结果显示,抗人A42PD1单克隆抗体CH34和CH101能特异性识别人A42PD1而不识别PD1,而Western blot结果发现二者都能结合变性的人PD1和△42PD1但不能识别小鼠PD1。通过酵母表面展示、细胞内染色A42PD1截短蛋白和多肽ELISA等方法鉴定出单克隆抗体CH101所识别的表位。通过PR-PCR的方法克隆了单克隆抗体CH34和CH101的重链可变区和轻链序列并进行了测序。通过细胞内染色和流式细胞术的方法,我们鉴定出CD14+单核/巨噬细胞在受到重组蛋白sΔ42PD1Fc的刺激后分泌前炎性细胞因子。抗人A42PD1单克隆抗体CH34和CH101都不能阻断重组蛋白sΔ42PD1Fc刺激单核细胞产生前炎性细胞因子的过程。基于293T-A42PD1细胞的研究发现,A42PD1与PD1一样,在与PBMCs表面表达的配体结合后可抑制细胞内AKT信号通路的活化。抗人A42PD1单克隆抗体CH34和CH101在与293T-A42PD1细胞结合后,并不会触发A42PD1向细胞内传递信号。且单克隆抗体CH34和CH101也不会阻断PBMCs表面某种未知配体对A42PD1信号通路的激活。相反,单克隆抗体CH101似乎还能够增强PBMCs表面某种未知配体对A42PD1信号通路的激活作用。基于抗人A42PD1单克隆抗体CH34和CH101,我们建立了双抗体夹心ELISA的方法,可特异性检测体液中sA42PD1,而不受sPD1的干扰。利用这种方法我们发现,与健康人相比,HIV感染者血浆中sΔ42PD1水平显著性增高。这一结果提示sΔ42PD1可能在HIV感染过程中起到一定的作用。PD1诱导性表达于活化的T细胞和B细胞表面,通过抑制TCR和BCR信号通路调节适应性免疫应答。类似的是,Δ42PD1表达于骨髓来源的固有免疫细胞表面,可能通过其抑制性信号通路调节固有免疫应答。有意义的是,我们制备了抗人Δ42PD1的单克隆抗体,为深入研究其免疫功能奠定了坚实的基础。