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目的:探讨巴西苏木素(brazilin,BN)对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)生物膜的形成及成熟生物膜的影响,为临床S.aureus生物膜相关感染的治疗提供实验依据。方法:1、BN对S.aureus生物膜形成的影响:首先构建S.aureus生物膜模型,确定生物膜形成时间,通过刚果红平板法初筛生物膜为阳性的临床菌株;采用番红染色法测定S.aureus生物膜的形成能力;再通过结晶紫染色法观察S.aureus的粘附情况,异硫氰酸荧光素-刀豆蛋白A(fluorescein isothiocyanate-conjugated concanavalin A,FITC-Con A)标记荧光显微镜技术和扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察生物膜形成情况及对生物膜模型进行鉴定。其次采用微量肉汤稀释法分别测定BN和万古霉素(vancomycin,VCM)对实验菌株的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。最后以VCM为阳性对照,采用结晶紫微孔板法和FITC-Con A标记荧光显微镜技术测定1MIC、1/2MIC、1/4MIC BN作用于S.aureus 6h、12h、24h、48h后对生物膜形成的影响。2、BN联合VCM对S.aureus成熟生物膜的影响:将1/2MIC、1MIC、2MIC浓度的BN和VCM,单独及联合用药作用于S.aureus成熟生物膜6h、12h、24h、48h后,采用结晶紫微孔板法和平板菌落计数法分别测定OD值及计数细菌菌落数;再将上述不同浓度BN及VCM单独及联合用药作用于成熟的S.aureus生物膜48h后,分别于荧光显微镜、激光共聚焦显微镜(confocal Laser scanning microscope,CLSM)、SEM下观察BN与VCM对S.aureus成熟生物膜的影响。3、BN对S.aureus生物膜相关基因的影响:采用Trizol法对S.aureus生物膜总RNA进行提取,实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测1/2MIC、1MIC、2MIC BN作用于成熟生物膜6h、12h、24h、48h后,对ica A(intercellular adhesion A,ica A)、ica R(intercellular adhesion regulatory R,ica R)、辅助基因调节因子A(accessory gene regulator A,agr A)的影响。结果:1、BN对S.aureus生物膜形成影响的结果:筛选50株临床菌株中有84%能形成生物膜,其中编号C-4-4生物膜形成能力最强,为本实验的实验菌株。粘附实验显示,2-4h玻片上几乎没有细菌粘附,4-6h玻片上有几个散在的细菌粘附,6-18h玻片上细菌相互聚集,18-36h出现紫色块状,36-48h紫色块状增多且增厚,48-72h局部紫色团块减少,细菌间变得疏松。荧光显微镜下观察,6h有几个散在的细菌,绿色荧光较少;12h细菌聚集,绿色荧光增多;24h有小块状绿色荧光;48h有大片绿色荧光,致密而厚重;72h有较疏松的绿色荧光。SEM下观察,6h细菌散在分布;12h细菌开始聚集,有少量的胞外基质;24h细菌胞外基质将细菌包裹;48h聚集成堆的细菌被胞外基质所包裹,可以看到膜状结构,偶而也可见散在的单个菌落;72h细菌聚集疏松。BN和VCM对S.aureus的MIC值分别为32μg/m L及0.5μg/m L。1MIC、1/2MIC、1/4MIC浓度BN作用于S.aureus 6h、12h、24h、48h后,除了6h、12h 1/4MIC BN无作用外,其余对生物膜形成均有作用,其中作用24h、48h效果最为显著,OD值均下降2倍以上,分别由0.726±0.119下降至0.346±0.127,1.133±0.283下降至0.450±0.121。荧光显微下观察,随着作用时间的延长及BN浓度的增加对生物膜形成的抑制作用增强;其中以48h1MIC BN效果最明显,仅见少量散在点状绿色荧光。2、BN联合VCM对S.aureus成熟生物膜影响的结果:1/2MIC、1MIC、2MIC浓度的BN和VCM,单独及联合用药作用于S.aureus成熟生物膜6h、12h、24h、48h后,BN与VCM联合应用时效果较单用时明显,以48h 2 MIC VCM+2MIC BN药物作用效果最佳,OD值由1.283±0.272下降至0.390±0.160;细菌菌落数由256.333±13.204下降至47.333±11.604;荧光显微镜下仅有少量绿色荧光;CLSM下可见大量红色荧光,偶见绿色荧光;SEM下膜状结构大量破坏,无胞外基质,出现散在的菌落。3、BN对S.aureus生物膜相关基因影响的结果:1/2MIC、1MIC、2MIC浓度的BN分别作用于ica A、ica R和agr A基因6h、12h、24h、48h后;BN对ica A表达量下调,以48h 2MIC BN下调最明显,由1下降至0.313±0.917;BN对ica R和agr A表达量上调,以48h 2MIC BN上调最明显,分别由1上升至4.581±0.560、3.049±0.225。结论:1、BN能够抑制S.aureus生物膜形成,在本实验范围内随着药物浓度的增加,效果越明显;2、BN单独用药对S.aureus成熟生物膜有一定的破坏作用,而VCM单独用药对S.aureus成熟生物膜破坏不明显,BN联合VCM比单独用药对S.aureus成熟生物膜作用明显;3、BN可能通过下调ica A及上调ica R和agr A基因的表达量而影响生物膜的形成。