脑卒中是危害人类生命与健康的常见病、多发病，迄今为止，唯一有效的治疗方法就是溶栓疗法，经过rt-PA治疗后有32％的病人有不同程度的好转，但必须在发作的3小时内使用，由于治疗窗和禁忌症的限制，只有5％的病人可使用该疗法。因此，进一步研究脑卒中的分子机制，研制开发具有自主知识产权的抗脑卒中新药意义重大。N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体是一种门控离子通道复合物，作为兴奋性氨基酸受体之一，主要分布于大脑皮层、海马、纹状体等部位，是兴奋性氨基酸递质传递的重要基础，同时是维持中枢神经系统功能正常的关键因素。NMDA受体介导的神经兴奋性毒性在缺血性脑损伤中起关键作用。NMDA受体拮抗剂的临床研究已进行了许多年，但其结果不尽如人意，目前所研发的NMDA受体拮抗剂主要分为以下三类：竞争性受体拮抗剂、离子通道阻断剂和甘氨酸位点拮抗剂。迄今还没有哪一类药物能成功地治疗脑中风和脑损伤患者，所有临床研究使用的NMDA受体拮抗剂均因疗效不确切或引起幻觉、昏迷、精神异常等严重的不良反应而被停用(如：selfotel、eliprodil、licostinel、lanicemine、UK2240455、SM231900等)。有研究者认为，NMDA受体拮抗剂阻断NMDA受体兴奋性毒性作用的同时也阻断了NMDA受体的正常生理功能。既然完全阻断NMDA受体不能达到有效地治疗效果，那么就需要阻断那些有害的NMDA受体。首先就要求我们区分损伤后哪些NMDA受体的激活后会引起有害作用，哪些会行使保护功能。由此引发了近年来关于NMDA受体的几个研究热点：突触内外NMDA受体的研究、NR2A和NR2B亚型的研究和PSD-95与NR2B偶联的研究。本部分的研究目的是：研究NR2A和NR2B亚型是否在调控神经元死亡中起着不同的作用，并对其分子机制作初步探讨。如果NR2B或NR2A真的与死亡或存活特异的联系在一起，那么将是一个很好的研究靶点。第一章N1／2A和NR2B亚型逆向调控神经元死亡目的：研究NR2A和NR2B亚基对神经元死亡的调控作用，并对其机理作初步探讨。方法：培养至11天的皮层神经元，分别给予谷氨酸、谷氨酸／NVP-AAM007和谷氨酸／Ro25-6981孵育24小时，观察LDH露出率、NO含量的变化；培养至11天的皮层神经元，分别给予谷氨酸、谷氨酸/NVP-AAM007和谷氨酸／Ro25-6981孵育1小时，观察NOS活性的变化；培养至10天的皮层神经元，分别给予NVP-AAM007和Ro25-6981孵育24小时，观察NOS表达的影响；培养至10天的皮层神经元，给予谷氨酸及不同浓度的7-NI，观察LDH漏出率的变化。结果：NVP-AAM007可增加由谷氨酸引起的LDH漏出率、NO含量和NOS活性的增加，Ro25-6981的作用则相反；NVP-AAM007和Ro25-6981对NOS表达没有影响；7-NI可阻止由谷氨酸引起的LDH漏出率增加。结论：NR2A和NR2B亚基通过调节NOS活性来影响谷氨酸兴奋性毒性作用。第二章NR2B在沙土鼠全脑缺血模型所致CAl神经元死亡中的作用目的：研究NR2B对在沙土鼠全脑缺血模型所致神经元死亡中的作用。方法：在沙土鼠全脑缺血再灌注模型，给予NR2B拮抗剂Ro25-6981和7-NI，通过NeuN染色、结晶紫染色和Fluoro-Jade染色法来观察对沙土鼠CAl神经元死亡的影响。结果：3种免疫组化方法均表明Ro25-6981和7-NI可对抗全脑缺血所致CAl区神经元死亡。结论：脑缺血时，NR2B可能通过调控nNOS活性来影响CAl区细胞的死亡。第三章基于NR2B／PSD95的治疗策略研究目的：采用药理学和分子生物学手段，研究在神经元内表达NR2B羧基端序列多肽是否能抑制兴奋性毒性神经元损伤。方法：直接合成引物进行配对PCR或从小鼠海马基因组DNA上进行扩增获得目的基因，将获得的目的基因连接到Stratagene公司的AAV-IRES-GFP质粒上，使用AAV Helpe-Free system来构建能表达NR2B羧基端33个和200个氨基酸多肽的重组AAV病毒(AAV-33C-IRES-GFP and AAV-200C-IRES-GFP)，应用重组病毒感染原代神经元，观察其是否能阻断由谷氨酸引起的神经元损伤。结果：形态学观察表明，重组病毒AAV-33C-IRES-GFP and AAV-200C-IRES-GFP感染的神经元在谷氨酸损伤后，神经元形态良好，突起清晰可见；而AAV-GFP感染的神经元在谷氨酸损伤后，细胞状态差，突起断裂消失。结论：在神经元内表达NR2B羧基端序列多肽可有效抑制谷氨酸引起的神经元损伤。