环形泰勒虫TαSDP基因的表达与功能的初步研究

来源 :中国农业科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zdllyd2009
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环形泰勒虫是一种蜱传血液原虫,能引起牛的热带泰勒虫病。环形泰勒虫和小泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞在体外表现具有无限增值(永生化)的能力,即其具有转化宿主淋巴细胞的特性,因此被称为可转化淋巴细胞泰勒虫。泰勒属的寄生虫是截止目前已发现的可使哺乳动物细胞发生永生化的唯一一类真核生物,为寄生虫与宿主相互作用研究提供了理想模型。截至目前,人们已经揭示了可转化淋巴细胞泰勒虫参与调控宿主细胞的部分机制,涉及到的分子有TashAT(Theileria annulata macroschizont-specific AT hook-containing protein)、SVSP(subtelomere-encodedvariable secreted protein)等,并证明与NF-κB、ISG15、TGF-β、PI-3K、E2F等分子及凋亡调控路径有关。目前,人们已经证明了小泰勒虫TpSCOP(T.parva schizont-derived cytoskeleton-bindingprotein)蛋白能够激活宿主细胞的NF-κB通路,进而实现对宿主细胞的调控。由于环形泰勒虫TaSDP(T.annulata schizont-derived protein)蛋白与已知的的小泰勒虫TpSCOP蛋白为同源蛋白。本研究对TaSDP基因进行了原核表达,利用了原核表达获得的重组蛋白制备了兔源多克隆抗体并对该蛋白在环形泰勒虫感染细胞上进行了定位,同时运用双荧光素酶报告基因系统就该蛋白对HEK293T细胞NF-κB信号通路的影响做了初步的探索,确定了电穿孔转染环形泰勒虫感染细胞的最佳电转缓冲液和电压,为研究环形泰勒虫TaSDP蛋白在转化的宿主细胞中的作用奠定基础。主要研究结果如下:  1.TaSDP基因的表达及TaSDP蛋白多克隆抗体的制备。利用PCR技术从环形泰勒虫cDNA中扩增TaSDP基因,构建原核表达载体进行蛋白的表达,rTaSDP蛋白以包涵体的形式存在;将纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。制备的抗体不仅可与重组表达的His-TaSDP发生反应,而且可以识别天然的虫体蛋白,为开展其在细胞调控方面的研究准备了材料。  2.TaSDP蛋白在环形泰勒虫感染细胞中的定位。为探寻TaSDP蛋白在环形泰勒虫感染细胞内的位置,以纯化的抗rTaSDP蛋白免疫血清为一抗,运用间接免疫荧光实验,并借助于激光共聚焦显微镜对该蛋白进行细胞定位。结果表明,TaSDP蛋白定位于环形泰勒虫裂殖体上。该蛋白可以作为一个标记分子用于后续裂殖体相关的研究。  3.TaSDP蛋白对HEK293T细胞内NF-κB转录活性的影响。为确定环形泰勒虫TaSDP蛋白对HEK293T细胞内NF-κB转录活性的影响,运用了双荧光素酶报告基因系统。结果表明:TaSDP蛋白对HEK293T细胞内NF-κB通路具有显著激活作用,活性升高大约1.7倍。实验中对环形泰勒虫感染细胞的C5细胞系的电转染条件进行了筛选,确定了最佳的电转缓冲液及相应的最适电压。为将双荧光素酶报告基因系统用于环形泰勒虫感染细胞的研究奠定了基础。
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