[背景]我国烧伤治疗水平领先世界,LA50(半数致死面积)已经达到98%以上,但绝大部分患者都是瘢痕愈合,后期生存生活质量依然受到严重影响,对于损伤修复和瘢痕形成的机制及其防治,仍然有不少问题亟待解决,远没有达到"无瘢痕愈合"的境界。2007年上海瑞金医院陆树良教授提出适度的炎症反应是创面良好修复的必要条件,但由于创面愈合及瘢痕纤维化形成机制复杂性,国内外相关研究仍然缺乏完整而系统的认识,对适度炎症反应的阐释也不尽相同;因此,进一步探讨组织损伤修复与瘢痕形成的机制,探讨在创面愈合早期有效防治危害性瘢痕的形成,提高创面愈合质量,对于临床意义重大,是现代医学模式下人文医学、再生医学发展的客观要求,也是烧伤转化医学在临床应用价值的体现。本课题组李跃华教授的一项前期研究发现,小分子化合物TIR/BB环拟似物AS-1可以通过抑制IL-1R介导的MyD88信号通路改善压力过负荷诱导的心肌肥大,虽然压力过负荷诱导的心肌肥大、间质炎症反应、心肌纤维化等病理生理过程与深度烧伤引起的损伤皮肤组织炎症反应、创面愈合、瘢痕纤维化之间有一定的相似性,但不同的疾病,不同的阶段,不同的组织,同样的物质干预却未必能引起同样的转归和结局,而参与调控生物学效应的机制亦可能不尽相同。AS-1能否在深度烧伤组织中有效起到调控过度炎症反应,防止瘢痕纤维化形成,提高创面愈合质量的作用;通过什么机制实现生物学效应;对解决临床实际问题有无启示和指导意义,均有待实验进行论证。[目的]观察TIR/BB环拟似物AS-1对小鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合及瘢痕形成的影响,验证其相关的分子信号传导通路,并在一定范围内阐述其作用机制;通过对临床实际损伤修复不同转归的病例进行对比分析,探寻某些潜在的能够体现适度炎症反应和防治瘢痕化的可能调控点。[方法]第一部分:将42只6-8周C57BL/6小鼠随机分为六组,分别为假烧伤组(S组)、烧伤组(B组)、AS-1急性炎症反应期治疗组(TA组)、AS-1溶媒二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)急性炎症反应期对照组(DA组)、AS-1慢性炎症反应期治疗组(TC组)、AS-1溶媒DMSO慢性炎症反应期对照组(DC组),每组7只,实验组小鼠背部先以100 g/L的硫化钡脱毛,然后于腹腔内注射20g/L的戊巴比妥钠0.5ml麻醉,将直径为3.0cm的电热烧伤仪金属片紧贴小鼠背部皮肤于80℃烫8s构建深Ⅱ度烧伤模型,每只鼠背部创面以生理盐水及凡士林纱布敷盖,每日清洁换药;AS-1急性炎症反应期治疗组自伤后8小时起,AS-1慢性炎症反应期治疗组自伤后2周起,每日腹腔内注射50mg/KgAS-1,DMSO溶媒急性炎症反应期对照组自伤后8小时起,DMSO溶媒慢性炎症反应期对照组自伤后2周起,每日腹腔内注射50mg/KgDMSO,烧伤组仅给予每日清洁换药;伤后3周观察小鼠鼠背创面组织愈合的大体情况,计算创面愈合率;收集组织标本,制作成切片,分别进行H.E染色和Masson染色,观察创面组织形态变化,运用图像分析软件分析Masson染色下各组纤维化面积;常规法提取创面组织mRNA,采用实时荧光RealTimePCR法检测创面组织IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1、TIMP-1、CTGF的mRNA表达水平,了解AS-1可能影响到创面修复和瘢痕形成的细胞因子;运用qRT-PCR和Western Blot检测伤后3周小鼠创面组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA和蛋白的表达,并比较各组差异;第二部分:28只小鼠随机分为四组,即对照组、烧伤组、AS-1治疗组(TA组),AS-1溶媒DMSO对照组(DA组),每组7只,腹腔麻醉后采用与第一部分相同的方法造成鼠背部深Ⅱ度烧伤,每只鼠背部创面以生理盐水及凡士林纱布敷盖,每日清洁换药。TA组于伤后8小时、24小时、48小时、72小时腹腔内注射AS-1,DA组于相同时间点腹腔内注射DMSO,剂量均按50mg/κg给药;伤后96小时将小鼠麻醉后固定,称重,取其全层创面皮肤组织,运用qRT-PCR方法检测创面组织IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1、TIMP-1、CTGF的mRNA表达水平;Western Blot验证P38MAPK、ERK1/2、JNK、TAK1 磷酸化及TGFβ1、TRAF6、CTGF的蛋白表达水平,推断AS-1影响创面愈合质量可能的分子机制;第三部分:自2014年09月至2015年03月,顺序入选深Ⅱ度烧(烫)伤患者46例,所有患者均于伤后8小时、24小时、48小时、72小时、7天、14天、21天时采集外周静脉血进行IL-1 β、TNF-α水平的检测,健康志愿者组建的对照组在相同时间点进行血清采集,所有标本送至实验室后进行离心处理,吸出上层血清置于-80℃冰箱保存,集中检测数据后保存记录在患者数据资料库。患者伤愈出院后随访1年,根据温哥华瘢痕量表(Vancouver scar scale,VSS)对上述患者的瘢痕情况进行评分,并根据评分高低,设为轻度瘢痕增生组(评分1-5分),中度瘢痕增生组(评分6-10分),重度瘢痕增生组(评分11-15分),健康志愿者(评分0分)设为对照组,将患者及健康志愿者创面治疗期数据库资料调出,按照VSS量表得到的评价区组进行相应数据资料的区组,统计分析其组间和组内的差异,观察患者创面愈合期血清IL-1β、TNF-α的表达水平与增生性瘢痕之间的关系,综合评价其创面愈合的质量。[结果]第一部分:与S组比较,TA组伤后三周创面完全上皮化愈合,部分被毛重新生长,无明显创面收缩;B组、DA组、TC组、DC组创面均未完全愈合,仍有坏死组织未完全脱落,已经愈合的组织均伴有不同程度的瘢痕形成,其中B组、DA组、DC组创面收缩更为明显,TC组有少许被毛生成,各组创面愈合率,TA组与S组差异无统计学意义(P>0.05),而分别高于B组、DA组、TC组、DC组(P<0.05);H.E染色见:B组、DA组、TC组、DC组表皮均质变及肉芽组织增生较为明显,胶原纤维排列紊乱,呈束状排列为主,含较多新生毛细血管及梭形成纤维细胞,其中B组棘细胞层增厚明显,并仍有较多炎症细胞浸润,TA组则与S组形态较接近,表皮均质变少,新生胶原纤维排列相对有序,并可交织为网状;Masson染色可见:B组、DA组、TC组、DC组瘢痕纤维化程度较S组、TA组显著增高,部分纤维结缔组织被不同程度肉芽组织替代,形成的蓝染区域较S组与TA组均明显扩大,胶原排列紊乱,纤维化面积定量分析示B组、DA组、TC组、DC组与S组纤维化差异明显(P<0.05),S组与TA组差异无统计学意义(P>0.05);伤后3周创面组织中IL-1β mRNA的表达TA组、TC组较B组显著降低(P<0.05);TNF-α mRNA表达TA组显著低于B组(P<0.05);TGF-β1 mRNA表达 TA 组较 B 组、DA 组、DC 组显著降低(P<0.05);MMP-1 mRNA 表达 TA 组较 B 组、TC 组显著降低(P<0.05);TIMP-1 mRNA表达TA组较B组显著增高(P<0.05);CTGF mRNA的表达TA组、TC组较B组显著降低(P<0.05);第二部分:伤后96小时,小鼠深Ⅱ度烧伤组较对照组组 IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 水平显著增高(P<0.01),AS-1 干预组 IL-1βmRNA、TNF-αmRNA、TGF-β1mRNA、MMP-1mRNA 水平较烧伤组、DMSO对照组显著下调(P<0.05);TI[MP-1 mRNA表达水平AS-1干预组较烧伤组、DMSO对照组的有明显上调(P<0.05);AS-1干预组较烧伤组的CTGFmRNA有显著下调(P<0.01),较DMSO对照组有所下调(P<0.05);Western Blot检测结果示烧伤组P38 MAPK、ERK1/2、JNK、TAK1的磷酸化程度高于AS-1干预组;TGFβ1、TRAF6、CTGF的蛋白表达烧伤组高于AS-1干预组;第三部分:与正常对照组相比,瘢痕各组在伤后各时点的血清IL-1β、TNF-α水平均有显著差异(P<0.01)。增生性瘢痕各组组间比较,轻度增生性瘢痕组在伤后8小时与中度、重度增生性瘢痕组血清IL-1β水平差异无明显统计学意义(P>0.05);其余各时点,均有显著差异(P<0.01);增生性瘢痕各组组间比较,轻度增生性瘢痕组在伤后8小时、24小时与中度、重度增生性瘢痕组血清TNF-α水平差异无明显统计学意义(P>0.05);其余各时点,均有显著差异(P<0.01)。.[结论]运用TIR/BB环拟似物AS-1对小鼠深Ⅱ度烧伤后创面皮肤组织在急性炎症反应期进行干预,可以有效促进伤后3周创面愈合率,减轻瘢痕纤维化,从而提高其创面愈合质量;AS-1可以显著下调小鼠深Ⅱ度烧伤后3周创面组织中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1、CTGF mRNA 在组织中的表达水平,上调 TIMP-1 mRNA的表达,使Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白水平均显著下调,对Ⅲ型胶原mRNA及蛋白水平无明显影响;AS-1调控小鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合质量可能是通过IL-1R介导的MyD88依赖型NF-κB信号转导通路以及MAPKs/TGFβ1/TRAF6信号通路发挥生物学效应;临床上,可以尝试以伤后8小时的血清IL-1β水平、伤后8小时和伤后24小时的血清TNF-α水平可以作为判断深Ⅱ度烧伤患者瘢痕预后的两个参考指标,AS-1进一步实施临床试验,适宜在伤后24小时内进行干预。