【摘 要】
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真核生物核糖体的生物发生过程是从前体r RNA(pre-r RNA)在核仁中的转录开始的。最早的pre-r RNA从5端到3端依次由以下几个部分组成:5外部转录间隔区(5external transcribed spacer,5ETS),18S r RNA,内部转录间隔区1(internal transcribed spacer1,ITS1),5.8S r RNA,ITS2,25S r RNA和3
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真核生物核糖体的生物发生过程是从前体r RNA(pre-r RNA)在核仁中的转录开始的。最早的pre-r RNA从5端到3端依次由以下几个部分组成:5外部转录间隔区(5external transcribed spacer,5ETS),18S r RNA,内部转录间隔区1(internal transcribed spacer1,ITS1),5.8S r RNA,ITS2,25S r RNA和3ETS。在pre-r RNA的成熟过程中,四个转录间隔区会被有序的进行剪切。核糖体中的18S,5.8S和25S的基因序列在大多数生物中趋于保守,而外部转录间隔区5ETS,3ETS和内部转录间隔区ITS1以及ITS2作为非编码区,承受的选择压力较小,相对变化较大,但是5ETS对于90S核糖体前体的组装以及核糖体前体的生物发生过程是必需的。我们在这项工作中对于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的5ETS的结构功能进行了分析。我们修订了之前的5ETS的二级结构模型。为了研究5ETS各个区域对于18S r RNA发生过程的影响,我们采用了一个可以表达所需pre-r RNA的质粒系统,并且构建了一系列融合了RNA标签,对5ETS进行了缺失和突变的prer RNA片段进行了表达。该研究中通过质粒互补生长实验以及Northern blot杂交实验来探寻5ETS中的功能序列区域。通过RNA标签和蛋白串联亲和纯化(Tandem Affinity Purification,TAP)标签得到了不同的pre-r RNA与蛋白的形成的复合体,采用半定量质谱鉴定了复合物中蛋白质的组分。根据我们的研究结果,我们发现在5ETS中虽然只有少部分功能序列,但这部分序列对于18S r RNA的成熟是必需的。H2和H3中间的连接区域,H3和H4的部分区域对于18S加工过程是重要的,同时这些序列可能也是募集UTPA复合物的关键区域。H5的5区域对于很多5ETS蛋白因子的募集起到了关键的作用。缺失H6并不会引起5ETS因子的缺失但会引起18S加工过程停滞。A0位点附近序列以及H10的缺失也会阻断18S r RNA的成熟进程。H2的顶部序列,H3的3序列,H7,H10的缺失也会部分影响18S r RNA的加工过程。我们的工作揭示了5ETS的结构和功能,对理解其在18S加工进程中的作用有重要意义。
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