皮肤光老化(skin photoaging)是一个与皮肤损伤有许多病理学相似点的复杂过程,在组织病理学上主要表现为胶原成分的减少和弹性纤维变性沉积等皮肤基质构成成分改变。外在的老化受复杂的环境因素调节,包括吸烟、化学物质暴露和紫外线暴露。UV照射通过两个相互调节的通路造成Ⅰ型胶原的减少：刺激胶原的降解和抑制前胶原的合成。因此,UV诱导的Ⅰ型前胶原(Collagen type Ⅰ,COLI)的合成的下降是皮肤光老化病理生理学中重要因素。研究表明光损伤中最重要的皮肤再生过程即为胶原重塑,在胶原重塑中成纤维细胞为最主要的胶原产生细胞。现今细胞治疗和激光治疗已被广泛应用于光老化皮肤的治疗。脂肪源性干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)因其中分泌的细胞因子和生长因子不仅可以刺激胶原的合成还能促进真皮成纤维细胞(human dermal fibroblast, HDF)的迁移,以此治疗皮肤光老化。而同样,CO2点阵激光(carbon deoxide fractional laser)被公认为是治,疗面部皮肤光老化的“金标准”措施,它通过局灶性光热作用原理达到治疗目的,从而改善动物模型的光老化。转化生长因子(transforming growth factor, TGF-β)作为脂肪源性干细胞分泌的主要生长因子能刺激成纤维细胞增殖,增加包括胶原蛋白在内的细胞外基质蛋白的合成和分泌。在真皮成纤维细胞核内,β连环蛋白(β-catenin)表达水平的持续增高,既可以促进成纤维细胞的增殖与迁移,同时又可以反馈激活TGF-β信号通路。已有文献表明经典Wnt/β-catenin信号通路中的Wnt3a是一类通路胞外配体,它能够以β-catenin依赖的方式介导Smad2水平升高,进而上调TGF-β表达,促进肌成纤维细胞的分化,从而改善创面愈合情况。同时,也有文献报道适时地激活Wnt信号通路可以诱使皮肤再生及其附属器的重建。但是,wnt/β-catenin信号通路却很少用于光老化的研究。在ADSCs移植治疗皮肤光老化的机制中发生作用也并未有过报道。基于以上研究背景,本研究通过H&E染色、VVG染色,COLI免疫组化,真皮厚度的测量,SOD/MDA酶学指标等验证ADSCs移植与CO2点阵激光联合治疗两种临床皮肤光老化治疗手段的联合治疗作用。同时检测wnt3a,β-catenin, TGF-β2, COLI在光老化组织及正常皮肤组织中的表达,进一步验证激活Wnt/β-catenin信号通路是否参与了脂肪源性干细胞(adipose derived stem cell,ADSC)治疗皮肤光老化的作用过程。此外通过体外培养人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblast, HDF)制备皮肤光老化模型,利用ADSC培养上清与HDF共培养,同时在ADSCs培养上清中加入wnt3a抑制剂SFRP2,在细胞水平检测Wnt/β-catenin信号通路在其培养前后及加入抑制剂后的表达水平,探讨Wnt/β-catenin信号通路是否在脂肪源性干细胞(adiposederived stem cell,ADSC)促进人真皮成纤维细胞增殖过程中参与治疗皮肤光老化的作用过程。一、皮肤光老化模型的制备以及ADSC、CO2点阵激光联合治疗目的:脂肪干细胞移植治疗皮肤老化是国际前沿技术,应用还在摸索阶段,而CO2点阵激光被公认为是治疗面部皮肤光老化的“金标准”措施。两种治疗方法联合,运用科学的病例对照研究、H&E、VG染色,COLI免疫组化,真皮厚度的测量,SOD/MDA酶学指标验证两种临床皮肤光老化治疗手段及其联合作用在病理生理学角度的效果。方法：1.酶消化法分离人脂肪源性干细胞(ADSC)；2.流式细胞术鉴定干细胞标志；3.MTT法测定ADSC细胞增殖率;4.细胞成脂、成骨诱导；5.制备大鼠皮肤光老化模型,分5组：①对照组;②模型组；③ADSCs治疗组;④DSCs+CO2点阵激光治疗组；⑤C02点阵激光治疗组；6.DAPI示踪14天；7.免疫组织化学检测五组中COLI的分布差异；8.采用H&E和VVG染色等病理学方法检测以上各组在治疗前后组织形态学的变化情况；9.通过SOD和MDA酶学指标检测皮肤抗氧化能力；结果：H&E染色后可见ADSCs和C02点阵激光联合治疗组与模型组相比Ⅰ型胶原纤维增加,真皮浅层出现新生、致密纤细的胶原纤维,变性卷曲纤维代谢,治疗效果最为明显著。ADSCs和CO2点阵激光联合治疗组与单独ADSCs注射治疗或CO2点阵激光相比真皮厚度增加更为明显。VVG染色可见与正常组大鼠相比,照射组大鼠胶原纤维含量减少,染色变浅,弹性纤维增多、变粗,部分断裂、缠结。COLI免疫组化结果可见在ADSCs和C02点阵激光联合治疗组中,COLI治疗后增加最为明显,同样在超氧化物歧化酶(SOD)水平与模型组相比明显增高,丙二醛(MDA)水平明显减低。结论：依据病理免疫组化结果和染色结果显示,大鼠光老化模型制备成功,且比较ADSCs单纯移植治疗组、CO2点阵激光治疗组以及ADSCs和CO2点阵激光联合治疗组治疗效果,联合治疗组效果最为明显。验证推论ADSCs注射联合CO2点阵激光治疗皮肤光老化效果叠加,为光老化的治疗提供新的途径。二、Wnt/β-catenin信号通路在光老化皮肤组织治疗前后的差异性表达目的：本实验通过比较正常皮肤组织、光老化皮肤和治疗后组织中wnt信号通路中wnt3a、β-catenin是否存在差异表达,以及与TGF-β2的表达相关性。探讨wnt信号通路在ADSC治疗皮肤光老化过程中起到的作用及意义。方法：通过Q-PCR、Western Blot和免疫组织化学方法检测wnt3a、β-catenin、 TGF-β2在皮肤组织以及模型皮肤组织和治疗前后模型组织的表达。结果：Western Blot结果显示,wnt3a、β-catenin在皮肤光老化模型组织中表达量较正常皮肤组织明显降低,且二者存在显著性差异(P<0.01)。而在ADSCs移植治疗组,与模型组组织比较降低的表达量明显上调,且与TGF-β2表达呈正相关,在ADSCs移植和C02点阵激光联合治疗组上调的表达量最为显著。结论：依据分子和蛋白水平检测结果证实Wnt/β-catenin信号通路在ADSCs治疗皮肤光老化的作用过程中表达水平随之变化。结合病理学检测结果,推测在ADSCs介导细胞外基质蛋白的重建和成纤维细胞增殖的过程中,Wnt/β-catenin信号通路极有可能参与其中,进而促进胶原的形成。因此,有望将Wnt/β-catenin信号通路作为皮肤光老化治疗的靶点,为皮肤光老化的治疗提供新的途径。三、下调wnt3a表达在ADSCs移植过程中对人真皮成纤维细胞的影响目的：研究ASFM对体外分离的人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblast,HDF)在UVB照射损伤后不同时间段的保护作用。经过一系列细胞、分子、蛋白水平检测分析wnt3a表达下调对ADSCs移植治疗人真皮成纤维细胞光老化模型过程中起到的影响和作用。方法：制备细胞光老化模型HDF,收集并制备人脂肪源性干细胞无血清培养上清(adipose derived stem cells-serum-free culturing medium,ASFM),共培养12h HDF光老化细胞模型组、共培养24h HDF光老化细胞模型组、共培养48h HDF光老化细胞模型组。MTT、细胞周期实验检测对比照射组,ASFM共培养光老化HDF后对其生长的改善。Western Blot检测ASFM共培养前后光老化HDF中wnt3a、β-catenim TGF-β2、COLI蛋白表达的变化。以及对比使用SFPR2(wnt3a拮抗剂)加入ASFM后对wnt3a的干扰效果,以及对β-catenin、TGF-β2、COLI蛋白表达的变化。结果：流式细胞仪检测结果显示,共培养ASFM后的HDF光老化模型的细胞生长比率明显高于模型组(P<0.05)。Western Blot检测结果显示,随着共培养ASFM12h、24h、48h后,HDF光老化模型中wnt3a、β-catenin、TGF-β2、COLI的蛋白表达较单纯DMEM高糖培养基培养HDF模型组逐渐增高。加入SFRP2抑制剂以后,ASFM培养的成纤维细胞内wnt3a、β-catenin、TGF-β较未干预组显著降低。结论：wnt/β-catenin信号参与调控多种细胞的增殖、凋亡、分化迁移和粘附。研究发现wnt3a、β-catenin、TGF-β、COLI在HDF光老化模型中的表达显著低于正常HDF。而利用脂肪源性干细胞无血清培养上清共培养HDF光老化模型后,四种蛋白表达显著上调。利用wnt3a抑制剂SFRP2干预wnt3a表达后,脂肪源性干细胞无血清培养上清共培养HDF光老化模型中β-catenin、TGF-β2、COLI的表达显著下调。提示wnt/β-catenin信号通路极有可能参与到ADSC移植治疗皮肤光老化的机制中,从而促进细胞外基质的合成,包括成纤维细胞中Ⅰ型和Ⅲ型胶原。实验结果为我们提供了ADSC治疗皮肤光老化的新机制,为再生医学中细胞治疗皮肤光老化提供了的部分依据。