结肠癌在全球都是发病率及致死率极高的肿瘤。在美国,其发病率及致死率均排名第三。有一半以上的结肠癌患者在发病时已是Ⅱ期或者Ⅲ期;在这些患者中,20%-50%将会复发,并且74%的患者是在接受手术和/或辅助化疗的三年内复发。一些临床病理的预测指标如TNM分期的T4或者N2、组织病理提示肿瘤低分化、以及手术中未达最佳标准的淋巴结切除等等,均能作为结肠癌复发的高危因素。即便如此,临床上仍缺乏能预测哪些患者能在化疗中获益的手段。毋庸置疑,在过去的几十年时间里,辅助化疗仍然是所有的Ⅲ期结肠癌患者不可替代的治疗。但是,化疗是否能真正使Ⅱ期结肠癌患者获益一直富有争议。因此,在现有临床病理危险因素的基础上,探索能对预后及治疗有预测意义的标志物显得势在必行,尤其是对于Ⅱ期的结肠癌患者而言。尽管接受了手术干预,Ⅱ和Ⅲ期患者的20%-50%会发展成复发性疾病,且他们中的74%是在确诊后前3年。对于Ⅱ期的患者,目前的治疗指南不主张使用辅助化疗。Ⅱ期患者中,疾病复发的高危特征包括肠梗阻T4疾病、手术清扫淋巴结<10、淋巴管浸润、低分化组织学等等。辅助奥沙利铂治疗有可能对于存在高危因素的Ⅱ期患者有益,但目前还没有得到重视。近期,QUASAR协作组主张对所有的Ⅱ期患者在手术切除后都进行辅助化疗,但并没有推荐最佳的方案。基于奥沙利铂的化疗已被批准用于所有Ⅲ期结肠癌患者,并已确定为能降低24%的复发风险。采用辅助化疗只对总生存率有10%的绝对改善。鉴于总体生存率的获益表现,辅助治疗的作用仍存在争议。结肠癌在世界上是最常见的恶性肿瘤之一。每年大约有超过一亿人获得结肠癌和超过百万人死于结肠癌。发病人群遍及世界各地,不同生活方式、环境、和遗传学均是发病原因。流行病学研究已经确定了许多危险因素,包括年龄、家族史、炎症性肠病;预防的危险因素,例如肥胖、酗酒、过量红肉类和加工肉类的摄入、高脂肪饮食、吸烟、社会经济地位低和久坐的生活方式。结肠癌的病因最常见是偶发型结肠癌,但也可能是遗传型家族性腺瘤息肉病(FAP)和遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)。无论如何,结肠癌的发展涉及基因突变导致的从肠粘膜的正常上皮细胞-腺瘤到癌的进展。由于这种连续的进展,使得我们可以在早期的自然病程及时的干预它,同时在将来的手术、放疗、化疗中进行个体化的诊治。结肠癌的预后取决于诊断癌症的时间。TNM分期是美国联合委员会(AJCC)的分期系统,是针对结肠癌最标准的分期。检测早期结肠癌可以获得90%的5年生存率,相比之下远处转移仅有12%。鉴于症状往往不很明显,结肠癌的检测在很大程度上依赖于筛查。在过去的二十年中,筛选的方法包括肠镜、大便潜血测试(FOBT)、和钡灌肠,从而导致结肠癌在很多国家的死亡率呈下降趋势。不幸的是,少于40%结肠癌的患者在疾病早期被诊断,因此早期诊断和治疗是成败的关键。此外,仅在50%高危患者中坚持这样的筛选程序是不够的。内镜具有侵入性且价格昂贵,而较少侵入和较便宜的方法在病例对照研究中仅具有47%-73%的灵敏度。因此,临床上迫切的需要找出用于诊断和预后的非侵入性结肠癌的标记物。最近的研究提示microRNA(miRNA)是结肠癌发生发展的重要组成部分。MicroRNA是小的未编码RNA,与肿瘤的发生、发展密切相关。既往的研究表明,microRNA有可能成为多种肿瘤的预测标志物。MicroRNA在肿瘤、正常组织中和循环DNA中的检测结果提示,各种各样的miRNA与肿瘤的进展和/或患者的生存期相关。外泌体作为肿瘤的诊断和预后判断标志物在近期吸引了越来越多研究者的注意力。外泌体是直径约为50-150nm的囊泡样结构,由包括肿瘤细胞在内的多种类型细胞分泌形成,同时它能从包括血浆和血清等多种体液中分离出来。外泌体保护包括DNA、RNA和蛋白分子等多种遗传信息,而且这些组分主要存在于循环当中。肿瘤中分离得到的外泌体有可能是肿瘤转移的媒介物。分泌肿瘤特异性的外泌体能得到很多肿瘤的DNA、RNA、miRNA以及蛋白信息。这些信息均能为肿瘤诊断和治疗提供帮助。在过去的十年中,研究表明,microRNA(miRNA)参与大肠癌的发生和发展。这种非编码RNA,调节的肿瘤相关基因的表达并参与重要的细胞功能,如细胞分化、增殖和凋亡。特定的miRNA可抑制癌基因或调控基因的表达。研究者们通过采用循环血清miRNA与粪便miRNA表达作为非侵入性标志物,以便及早发现结直肠癌。在这里,恶性肿瘤是复杂的结构,是由癌细胞和周围肿瘤基质共同组成的。新的证据表明,外泌体可在癌症细胞局部和全身发挥关键通讯作用。外泌体是从不同的正常和肿瘤细胞系培养物中产生的与5’-核苷酸的活性相关的小泡,反映了胞外酶的活性。40-100纳米直径囊泡,它们被称为外泌体。进一步的研究显示,外泌体是40-100纳米尺寸的内吞性膜囊泡。它们含有microRNA(miRNA),message RNA(mRNA)、DNA片段和蛋白质。外泌体可以从供体细胞到受体细胞中穿梭。肿瘤细胞和肿瘤微环境之间的信息传递成为了癌症研究的新领域。目前被广泛接受的是,癌细胞可以对周围的环境发挥深远的影响,通过改变微环境从而使得细胞从正常到肿瘤的持续生长、侵袭和耐药性。外囊泡,尤其是外泌体,目前被认为是传播者间的一个新的类别,它们正在成为首要在控制肿瘤及其与周围环境之间的相互作用的重要递质。外泌体从癌细胞或从肿瘤微环境的细胞的承载生物学信息的横向转移,它们的生物合成过程中功能蛋白和核酸都是由外泌体加载。虽然人类在对抗癌症已经取得巨大的进步,但它仍然是死亡的首要原因.在二十一世纪,人们对癌细胞的生物学有更深的了解,以开发新的治疗策略。在过去的三十年里,研究人员和临床医生大多集中于癌症特异性的识别和靶向治疗的发展,从而减少不必要的副作用。这种全球性的努力已导致一些有前途的、高效的小分子靶向肿瘤特异性药物的发展。通过改变信号转导途径改变和/或控制细胞增殖和癌细胞的存活是未来的新方向之一。此外,一系列的单克隆抗体已被开发,并获得FDA批准,例如,ERBB2在乳腺癌,CD20或CD52的慢性淋巴细胞性白血病;允许存活途径的特定调制(利用作为裸抗体时),或有毒的有效载荷的靶向递送(当作为偶联抗体利用)。虽然这种方法已被证明有效的,但有明显的缺点;第一,因为恶性细胞的克隆演变的关系,癌症的特征在于丰富的异质性和各种亚型,使得它难以识别独特的目标的根除所有的肿瘤细胞;第二,更重要的是,事实上,有越来越多的证据表明肿瘤的生长作为一个整体也可通过它播种环境和宿主的影响生物体。肿瘤细胞和组分,基质之间的相互作用周围肿瘤微环境的细胞、免疫细胞、和细胞外基质(ECM)都可能直接影响生长与原发肿瘤的抗药性,也控制其从后期和转移性阶段。据推测,复发性疾病的病因是在手术或放射评估中无法评估到的微小病变。因此,5-FU为基础的辅助化疗,旨在防止任何形式的肿瘤复发或转移。Ⅱ期和Ⅲ期患者存在的异质性归因于手术技术、淋巴结清扫的情况、肠梗阻或内脏穿孔、组织学、发病年龄、合并症、肿瘤的分子基础等。AJCC将Ⅲ期进一步细分为主要基于T和N分期的A、B或C,这些有可能是基于对已经存在的潜在不良预后特征的总和。事实上,对于5-FU或奥沙利铂的化疗具有抗性的患者,可能无法从6个月的辅助治疗中获得什么好处。此外,虽然结合奥沙利铂是目前在我们的辅助化疗方案中常用的,但这也可能会在增加的治疗相关毒性的成本。我们推测,患者病情反复与参与5-FU和奥沙利铂代谢的遗传多态性有关。但是,仅此可能无法了解病情反复发作的所有原因。采用血清蛋白质组学验证组织蛋白质组学可以提供一种辅助手段,以确定患者的所属人群。我们相信,基因组学,蛋白质组学,以及环境因素的综合分析,可以让我们发现与CEA相比更有优势的预后指标。我们研究项目的长期目标是探索新的策略,通过创建筛查和/或预防研究的标志物,以确定Ⅱ期和/或Ⅲ期的结肠癌患者,谁的复发的风险在增加。为了达到这个目标,我们将采取一个多步骤的方法。首先,我们将试图找出基因,蛋白组学和环境因素影响肿瘤复发的标志物。这项研究的数据可以作为日后的创作大规模协作组研究结肠癌预测模型的基础。我们希望这些结果将改变评估和治疗的所有阶段Ⅱ/Ⅲ结肠癌患者的现状,将个体化治疗运用到每一个病人身上。血清中外泌体miRNA作为结肠癌复发的预测指标曾在一项利用micro array技术在6例复发和未复发患者的血清样本有过探索性的研究,最终筛选出miR-19a作为预后的潜在标志物。为了系统的评价血清外泌体miRNA在Ⅱ或Ⅲ结肠癌患者中的诊断和预后判断价值,我们对84例TNM分期在Ⅱ期和Ⅲ期的结肠癌患者的基线血清样本,在提取外泌体RNA后进行测序,将筛选出的候选microRNA再利用qRT-PCR进行验证。在复发和未复发患者中,我们进行外泌体MiRNA的对比研究,旨在寻找出能对Ⅱ和Ⅲ期结肠癌患者的复发有预测意义的 microRNA。血清外泌体miR-4772-3p作为Ⅱ和Ⅲ期结肠癌患者复发的预测标志物目的:研究的目的旨在评估血清外泌体RNA预测Ⅱ期和Ⅲ期结肠癌复发的作用。方法:84例分期为Ⅱ和Ⅲ的结肠癌患者在接受肿瘤切除后和进行辅助化疗前,留取基线的血液标本。提取血清中的外泌体RNA,同时将复发和未复发组的患者中各选取年龄、性别、种族等均匹配的20例患者,每5例组成一个样本池。对8例样本池进行RNA测序。根据测序的结果,选取两组组间表达差异最大的microRNA在27例复发患者和57例未复发患者中进行q RT-PCR的验证。结果:共有145个差异表达的成熟miRNA在两组间差异表达(p<0.05),同时假阳性发现率小于0.05(FDR<0.05)的有50例miRNA。q RT-PCR对差异最大的十种microRNA进行验证。验证的结果显示,miR-4772-3p(P=0.002)在复发组中显著的低表达,而miR-4732-5p(P=0.044)显著的高表达。Logistic回归和ROC曲线分析证明了 mir-4772-3p对临床指标有着更好的预测价值。mir-4772-3p低表达患者与高表达患者有3.38倍的复发风险。ROC分析提示曲线下面积AUC为0.72,敏感度为78.6%,特异性为77.1%(P=0.001)。结论:血清外泌体miR-4772-3p低表达有可能成为Ⅱ或Ⅲ期结肠癌患者复发的预测标志物。