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目的:自噬(autophagy)是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜,包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体(autophagosome),并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物,以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器更新的基础代谢过程。研究表明,多种因素诸如氧化应激、饥饿、高温、细胞内损伤、细菌病毒感染等,都会诱发细胞自噬。细胞自噬对于机体正常稳态有重要意义:饥饿应答进程中,在不同的器官如肝脏或培养细胞,由于氨基酸的匮乏,会诱导自噬,后者分解大分子,以产生分解代谢和合成代谢过程中所必须的中间代谢物;在细胞正常活动过程中,如在动物的变态发育、老化和分化过程中,自噬负责蛋白降解以重建细胞。A族链球菌(GAS)是一类革兰氏阳性球菌,人类约90%的链球菌感染是由GAS引起的。感染GAS后可引起化脓性疾病,如局部皮肤及皮下组织感染等,中毒性疾病如猩红热等,变态反应性疾病如风湿热、急性肾小球肾炎等。GAS较强的侵袭力主要取决于其能产生多种胞外酶及毒素,例如脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)、M蛋白(M protein)、致热外毒素(pyrogenic exotoxin)、溶血素(hemolysins)等。这些胞外酶和毒素都有其各自功能,例如脂磷壁酸可以增强细菌对宿主细胞的粘附性;M蛋白是GAS的主要毒力因子;致热外毒素能改变血脑屏障的通透性;溶血素分为链球菌溶血素O和链球菌溶血素S,在链球菌引起超敏反应的过程中起着重要作用。在机体受到GAS入侵时,是否会发生细胞自噬;如果发生,那么GAS诱导细胞自噬的机制是什么?这些问题目前尚不清楚。本研究通过western blot,免疫荧光技术等检测GAS、GAS缺陷菌株及GAS缺陷菌株刺激人喉癌上皮细胞Hep2后,检测自噬相关蛋白LC3和P62的变化趋势,以及用免疫荧光的方法检测LC3蛋白的细胞原位表达变化来探究GAS全菌及其缺陷菌株是否诱导细胞发生自噬。而后,用纯化的M蛋白,Fba A蛋白刺激Hep2细胞以验证其在诱导自噬中的作用。接下来进一步用本室保存的分段蛋白刺激细胞,以寻找GAS诱导自噬发生的具体蛋白区段。方法:1用GAS刺激人喉癌上皮细胞Hep2,并用人肺癌细胞A549作为对照组,在侵袭细胞后,根据渗透压原理得到胞内菌,不同倍数稀释后涂于血平板培养基上,计算GAS的侵袭效率。2 Hep2细胞分别接受GAS,GAS缺陷菌株,GAS缺陷菌株刺激,用western blot检测自噬相关蛋白LC3,P62在不同时间点的表达变化。3 Hep2细胞分别接受GAS,GAS缺陷菌株,GAS缺陷菌株刺激,应用免疫荧光技术检测LC3的分布定位。4应用亲和层析法纯化Fba A蛋白,M蛋白。5 Hep2细胞分别接受两种蛋白的刺激后,用western blot检测自噬相关蛋白LC3,P62在不同浓度和不同时间点的表达变化。6用本实验室保存的分段Fba A蛋白分别刺激Hep2细胞,用western blot检测自噬相关蛋白LC3,P62在不同浓度和不同时间点的表达变化。结果:1 Hep2细胞受到GAS感染时的平均侵袭率为33%,而A549为25.6%。2 GAS和GAS缺陷菌株以MOI 1:100刺激Hep2细胞后,P62蛋白随着刺激时间逐渐减少,LC3的两种蛋白LC3-1逐渐降低,而LC3-2逐渐增加;当GAS缺陷菌株以MOI 1:100刺激细胞后,P62和LC3的两种蛋白均没有明显的特征性变化。3免疫荧光检测不同菌株刺激细胞后,LC3蛋白定位情况显示:当GAS和GAS缺陷菌株刺激Hep2细胞6小时后,LC3蛋白呈现出聚集分布。当GAS缺陷菌株刺激细胞后,LC3蛋白的弥散分布状态未改变。4 Fba A蛋白和M蛋白刺激细胞后,western blot结果显示:当Fba A蛋白刺激细胞后,P62蛋白随着刺激时间逐渐减少,同时LC3-1逐渐降低,而LC3-2逐渐增加;当M蛋白刺激细胞后,P62和LC3的两种蛋白均没有明显的特征性变化。5 Fba A的四种分段蛋白37-104,104-277,68-164,164-320,分别刺激Hep2细胞,结果显示:68-164区段蛋白刺激Hep2细胞后,呈现出自噬相关蛋白LC3-1随着时间逐渐降低的趋势,LC3-2随着时间逐渐升高的趋势;同时,自噬相关蛋白P62有随着时间逐渐降低的趋势。结论:1 GAS可以侵入Hep2及A549细胞,且侵袭率达到可研究水平。2 GAS及GAS缺陷菌株可诱导Hep2细胞发生自噬,而GAS缺陷菌株并未诱导细胞自噬的发生。3 GAS诱导Hep2细胞发生细胞自噬和GAS的毒性蛋白Fba A有关。4 Fba A诱导自噬的主要功能区定位于68-164蛋白区段内。