目的高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，HHcy)是一种以血浆总同型半胱氨酸(total homocysteine，tHcy)浓度升高为特征的病理状态，是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)类心血管疾病的危险因子。但迄今为止，血浆Hcy水平升高引起AS的发病机制并不完全清楚。目前多数研究认为，HHcy引起的血管内皮功能损害是AS发生的始动环节，机制之一是内皮源性一氧化氮(nitric oxide，NO)生物利用度降低。NO是内皮细胞合成的一种重要的血管活性物质，具有舒张血管，抑制血小板聚集，抑制白细胞粘附及平滑肌细胞增殖，减少氧自由基产生和低密度脂蛋白氧化等抗AS的作用，因此被称为“内源性抗动脉粥样硬化因子”。NO减少或生物利用度下降常出现内皮依赖性血管舒张功能障碍，导致血压升高和动脉硬化。目前的研究显示，Hcy可通过多种机制导致AS，而对内皮NO系统的损伤则可能主要经氧化应激和升高血中不对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)的浓度导致。两个Hcy分子的自由巯基(-SH)自氧化形成二硫键时产生两个自由电子，促进活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成，并氧化NO生成过氧亚硝基阴离子(ONOO~-)，ONOO~-亦是一个强毒性的氧化基团。ADMA是NOS的内源性抑制剂，可与L—精氨酸竞争结合NOS活性部位，从而减少NO合成。ADMA除了抑制NO生成外，还促进eNOS脱偶联，导致超氧阴离子及其它ROS生成增加，ROS水平升高可能导致内皮源性NO的氧化失活，这反过来可能引起NO生物利用度的进一步降低。但上述解释至今仍存在诸多疑点：①半胱氨酸(cysteine，Cy)与Hcy的分子结构极其相似，仅在碳链上少一个甲基，同样具有自由巯基，其自由巯基具有与Hcy分子的自由巯基相似的生化反应。且其血浆浓度远高于Hcy，大约是Hcy血浆浓度的20～30倍，但半胱氨酸并不被认为促进氧化应激和AS。②Hcy引起ADMA浓度升高亦被认为与Hcy的自由巯基有关，ADMA降解酶二甲基精氨酸二甲氨基水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH)的活性中心包含一个活性必需的游离半胱氨酸残基，Hcy的半胱氨酸残基与此半胱氨酸残基形成二硫键，导致酶的失活，从而阻断ADMA的降解，导致ADMA堆积、血浆浓度升高。但半胱氨酸亦具有相似的分子和巯基结构，因此，仅从Hcy自由巯基活跃的氧化—还原反应特性来解释其损伤效应显然有诸多牵强之处。Hcy和半胱氨酸代谢上的一个显著差异是Hcy参与一碳单位代谢，与DNA、蛋白质等许多物质的转甲基反应有关，半胱氨酸则无此功能。DNA的甲基化修饰是调控基因表达的重要方式，是近年来Epigenetics的研究热点。HHcy已被证明与许多基因的表达异常有关。因此，Hcy是否通过干扰NOS或DDAH基因的甲基化修饰进而影响NO系统的功能?目前尚未见有相关报导。本课题利用体外培养的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)，通过观察不同浓度Hcy对细胞eNOS及其通路的影响，从基因和蛋白质水平及其甲基化状态改变着手，探讨Hcy对内皮NO系统的损伤机制，为阐明Hcy在AS发生中的作用机制提供一全新的视角。方法利用体外培养HUVEC，传至第三代，加入不同浓度的Hcy(0，10，30，100，300μM)和5—氮杂脱氧胞苷(5μM)后培养72h，用RT-PCR检测细胞内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和DDAH mRNA水平；用免疫组织化学技术估测细胞eNOS蛋白表达水平；高效液相色谱测定细胞培养液中ADMA浓度；并分别测定细胞DDAH和eNOS活性及培养液中NO含量；用巢式甲基化特异性PCR(nested methylation-specific polymerase chain reaction，nMSP)检测细胞DDAH启动子区CpG岛甲基化状态。结果HUVEC与不同浓度Hcy培养72h后，免疫组织化学染色结果显示，对照组HUVEC内eNOS呈阳性表达，经Hcy处理后，细胞内eNOS表达减弱，图像分析结果显示，各组阳性细胞的积分光密度值分别为：对照组0.159±0.003，10μM组0.154±0.009，30μM组0.142±0.013，100μM组0.136±0.011，300μM组0.126±0.008。与对照组相比，30、100和300μM组有显著性差异(P＜0.05)。结果说明Hcy可抑制细胞eNOS蛋白表达，即eNOS蛋白表达呈现随Hcy浓度增加而降低的趋势。RT-PCR结果显示，eNOS mRNA表达呈现减少趋势。与对照组相比，100μM和300μM Hcy组具有统计学意义(P＜0.05)。10和30μM Hcy组细胞DDAH mRNA表达增加，而100和300μM Hcy组细胞DDAH mRNA表达减少。300μMHcy和5μM 5’-Aza与细胞共培养组，DDAH mRNA表达显著增加。10、30、100和300μM的Hcy与HUVEC共同培养72h后，各组细胞NOS活性(U／mgprot)分别为：对照组8.32±0.13；10μM Hcy组8.21±0.14；30μMHcy组8.16±0.03；100μM Hcy组7.97±0.14及300μM Hcy组7.91±0.08。与对照组相比，10和30μM Hcy处理对内皮细胞NOS活性没有明显影响，而100和300μM Hcy处理组细胞内eNOS活性降低(P＜0.05)。细胞DDAH活性分别为对照组细胞活性的百分比为92.67±9.51、78.67±6.66、52.17±6.25、31.88±5.67，呈剂量依赖性降低。与对照组相比，30、100和300μM组具有统计学意义(P＜0.05)。各组细胞NO含量分别为：对照组0.33±0.02；10μM Hcy组0.31±0.03；30μM Hcy组0.28±0.04；100μM Hcy组0.24±0.03及300μM Hcy组0.22±0.03。提示Hcy可使内皮细胞NO生成减少，并呈量效依赖关系。与对照组相比，30、100和300μM Hcy处理组具有统计学意义(P＜0.05)，而10μM Hcy处理组没有明显改变。各组细胞培养液中ADMA含量分别为：对照组0.55±0.08：10μM Hcy组0.63±0.09；30μM Hcy组0.82±0.09；100μM Hcy组1.24±0.10；300μM Hcy组1.48±0.07。可以看出，ADMA含量随Hcy浓度的增加而增大，并呈量效依赖关系。与对照组相比，30、100和300μM Hcy处理组具有统计学意义(P＜0.05)。将HUVEC细胞的DDAH活性与ADMA浓度、ADMA浓度与eNOS活性及eNOS活性与NO含量作散点图分析显示，细胞DDAH活性与其ADMA浓度及ADMA浓度与eNOS活性均呈明显负相关(R~2=0.92 and R~2=0.82，P＜0.05)，细胞eNOS活性与NO含量呈正相关(R~2=0.6267，P＜0.05)。即细胞DDAH活性降低，培养液中ADMA浓度升高；ADMA浓度越高，细胞eNOS活性越低，导致细胞NO生成减少。提示Hcy抑制了DDAH活性，引起细胞内ADMA聚积，而ADMA的增多则进一步抑制了eNOS活性，使细胞NO生成减少。MSP结果显示，DDAH甲基化引物和非甲基化引物均有目的片段扩增，说明细胞DDAH基因启动子区CpG岛存在一定程度的甲基化。但与对照组相比，10μM和30μM Hcy诱导基因低甲基化，而100μM和300μM Hcy使基因发生了高甲基化。但300μM Hcy与甲基化修饰拮抗5’-Aza(5μM)与HUVEC共培养后，细胞甲基化程度降低。结论(1)高同型半胱氨酸引起NO生成的减少与eNOS活性下降、ADMA升高、DDAH活性下降显示出高度的一致性，提示内源性ADMA的升高可能是血管内皮NO系统功能障碍的关键机制之一。(2)在DDAH↓／ADMA↑／NOS↓／NO↓的通路上，高浓度同型半胱氨酸引起DDAH基因启动区的高甲基化修饰，进而导致DDAH mRNA表达下调可能对DDAH活性下降发挥部分作用。(3)高浓度同型半胱氨酸引起DDAH基因启动区显著的高甲基化修饰，DDAH mRNA表达相应下调。但Hcy轻中度升高，DDAH mRNA表达升高或变化不明显，而DDAH活性下降表明Hcy与DDAH之间还存在其它作用机制。(4)ADMA升高可能是eNOS活性下降、NO生成减少的重要机制；但高浓度同型半胱氨酸亦引起eNOS mRNA表达下调，后者与eNOS活性下降、NO生成减少亦明显相关。(5)eNOS基因启动子缺乏CpG岛，似不应对甲基化修饰的调控方式产生反应。但本实验显示，高浓度同型半胱氨酸确能引起eNOS mRNA的表达下调，提示，高Hcy对eNOS基因的表达调控可能还涉及非CpG岛启动子甲基化修饰的其它方式。(6)Hcy引起的NO功能障碍除了氧化应激外，亦可能源于DDAH基因的异常甲基化修饰，DDAH的损害导致了ADMA升高，其竞争性抑制eNOS，使NO生成减少。这一过程可能是内皮功能障碍和AS发生的重要途径。