【背景】在我国,胃癌是死亡率最高的消化道恶性肿瘤之一,而胃癌的侵袭和转移是患者不良预后的主要原因,一经出现转移,胃癌患者的生存期常小于1年。胃癌的发生发展是一个相对复杂的生物学过程,而其转移常伴随着某些细胞因子及信号通路的改变。近几年,分子靶向治疗在多种肿瘤的临床实践中已经发挥了显著疗效,在无法切除的局部晚期或晚期的胃癌患者中,针对Her-2高表达的曲妥珠单抗靶向药物联合化疗大大提高了胃癌治疗的有效率,延长了患者的总生存期,成为了晚期胃癌患者治疗的里程碑事件。然而,Her-2基因扩增在胃癌患者中不足20%,可见,发掘胃癌侵袭和转移新的靶标分子可能会为胃癌的治疗提供一种新的方法,同时可以改善患者的生活质量,并延长患者的生存时间。Semaphorin3A(Sema3A),作为3型Sema的成员之一,是具有神经生长抑制作用的外分泌型蛋白,最早是在脊椎动物被鉴定的信号蛋白。近几年大量的研究证实,在多种恶性肿瘤中(如乳腺癌,前列腺癌,胰腺癌,恶性黑色素瘤等),Sema3A出现了不同程度的表达下调或缺失,参与了肿瘤恶性生物学行为的发生发展。我们课题组初步研究发现,与正常人外周血中的表达相比,Sema3A在胃癌患者外周血中是低表达的,提示Sema3A的表达下调可能在胃癌中也发挥了作用。为了进一步探讨Sema3A在胃癌发生发展中的作用及其相关的机制,本课题组设计了以下实验进行研究。【目的】1.研究Sema3A在胃癌患者以及胃癌组织中的表达情况,检测Sema3A在胃癌细胞系,尤其是高低转移潜能细胞系中的表达差异,观察其在胃癌发生发展中的作用;2.构建Sema3A过表达细胞株,利用体外增殖及侵袭迁移等实验探讨Sema3A在胃癌恶性生物学行为中的作用;3、初步探究Sema3A在胃癌的增殖及侵袭转移中的分子机制。【方法】1.通过ELISA、RT-PCR、Western Blot等实验方法检测胃癌患者外周血、胃癌组织、胃癌细胞系中Sema3A的表达;2.构建Sema3A过表达的慢病毒载体,并感染高转移能力的胃癌MKN28-M细胞,获得外源性稳定表达Sema3A的胃癌细胞株;3.在稳定表达Sema3A的胃癌细胞系中,通过MTT实验、平板集落克隆实验、流式细胞仪细胞凋亡实验等检测其对胃癌细胞MKN28-M凋亡的影响。4.通过Transwell侵袭实验以及细胞划痕实验研究Sema3A对胃癌细胞侵袭及迁移能力的影响;5.通过Western Blot实验检测细胞凋亡相关信号通路蛋白在Sema3A高表达及对照细胞系中的表达差异;6.利用Western Blot、RT-PCR实验检测上调Sema3A的表达对EMT发生的影响。【结果】1.与正常人相比,胃癌患者血清中Sema3A的表达明显降低;与癌旁组织相比,胃癌组织中Sema3A的表达明显降低或缺失,进一步分析病人的临床资料发现,Sema3A表达缺失的患者更易出现淋巴结转移这一现象。同样,Sema3A在高转移细胞系的表达也显著低于亲本胃癌细胞系。2.慢病毒包装Sema3A正义表达载体转染入胃癌细胞MKN28-M后,RT-PCR和Western blot实验证实上调了Sema3A基因的表达。3.体外实验证实外源性上调Sema3A的表达抑制了胃癌细胞的增殖,促进了胃癌细胞的凋亡。4.体外实验证实外源性上调Sema3A的表达降低了胃癌细胞的侵袭、迁移能力。5.外源性上调Sema3A后,抗凋亡蛋白Bcl-2,Bcl-xl表达下降,而促凋亡蛋白Bax,Fas-L表达增加。6.外源性上调Sema3A后,促进EMT发生的相关转录因子Slug、Zeb-1的表达减少,EMT相关的上皮标记分子E-cadherin表达增加,然而间质标记分子Vimentin、N-cadherin等表达则明显下降。上述结果提示Sema3A在胃癌细胞中表达的降低导致了胃癌细胞EMT的发生,促进了胃癌细胞侵袭转移,而上调Sema3A后逆转了这一现象。【结论】与正常对照组相对比,Sema3A在胃癌患者,组织胃癌患者外周血及转移潜能胃癌细胞株中均是表达下降的,且在胃癌高转移潜能MKN28-M细胞中表达最低,提示Sema3A表达下调在胃癌的发生发展中发挥作用。我们成功构建外源性过表达Sema3A基因的慢病毒载体,转染入MKN28-M细胞系后,上调Sema3A基因的表达后,通过体外表型实验证实Sema3A的过表达显著降低了胃癌高转移MKN28-M细胞系的增殖能力,抑制了侵袭、迁移能力。进一步探究Sema3A在胃癌增殖侵袭转移中的相关作用机制,发现上调Sema3A后是通过调节Bcl-2家族和死亡受体通路相关分子的表达变化来诱导胃癌细胞的凋亡,抑制胃癌细胞的增殖;同时通过逆转EMT的发生降低了胃癌细胞的侵袭能力。这些研究结果揭示,Sema3A对胃癌的发生发展具有抑制作用,可能为胃癌的靶向治疗提供了一定的实验基础。