黑冰片荧光碳点与GPC-3抗体偶联体对肝癌早期诊断技术研究

来源 :内蒙古医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:Aweichunxing890620
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目的:通过偶联黑冰片荧光碳点和GPC-3抗体靶向识别肝癌单癌细胞从而来提高肝癌早期诊断率。方法:1)制备黑冰片荧光碳点:称取1g蒙药黑冰片放入模拟制备的胃液里再将装有胃液的烧杯置于37度的油锅中在磁力搅拌器下搅拌12小时,12小时后收取胃液利用台式低温高速离心机离心收取上清存放于4度冰箱,将其沉淀物用蒸馏水清洗2次后再次放入已经制备好的模拟肠液中同样置于37度的油锅中在磁力搅拌器下搅拌12小时,再次离心收取上清存放4度冰箱。将两次的上清液装入透析膜置于装有蒸馏水的烧杯中存放48小时,期间要换两次烧杯中的蒸馏水。48小时后收取透析膜中的两种液体混合在一起,微波炉激发5分钟,放入冻干机内冻干收集其冻干粉避光保存于4度冰箱,通过红外光谱仪以及荧光分光光度计对其进行表征。2)将黑冰片荧光碳点与GPC-3抗体偶联,构建复合偶联体:在40微升的GPC-3单克隆抗体溶液中加入60微升醋酸缓冲液(0.05mol/L PH=4.2)和120微升过碘酸钠溶液(1.5mg/m L PH=4.2)在4度避光条件下不断搅拌2小时,2小时后在抗体溶液中加入黑冰片荧光碳点溶液(5mg/m L)同样在4度避光条件下不断搅拌20小时,20小时后在复合溶液中加入20微升硼氢化钠溶液(2mg/m L PH=7.1)4度避光条件下不断搅拌2小时,超滤后收取复合偶联体,通过红外光谱仪以及荧光分光光度计对其进行表征。3)用黑冰片荧光碳点以及复合偶联体对肝癌细胞成像:在肝癌细胞Hepg2状态好的时候于共聚焦培养皿中培养24小时分为空白组、黑冰片荧光碳点组、复合偶联体组给药2小时,之后将其培养液吸出,固定细胞避光保存在4度,利用共聚焦显微镜查看细胞与碳点、偶联体结合部位,拍照。结果:1)黑冰片荧光碳点在荧光显微镜下可以发出蓝、红、绿三种颜色,它的发射波长在420nm时达到最高峰,荧光发射峰峰宽而对称,显示出最大的荧光强度。测定黑冰片荧光碳点的红外吸收光谱图谱时其结果显示在3467 cm-1的吸收峰和O-H基团的特征峰相吻合,在1636 cm-1的吸收峰和-NH2的特征峰相吻合说明黑冰片荧光碳点其表面带有功能基团-NH2和-COOH。2)对比偶联体与黑冰片荧光碳点荧光发射图后发现最大峰值对应的波长出现了蓝移。说明偶联上GPC-3抗体后,对黑冰片荧光碳点的荧光产生了影响。黑冰片荧光碳点和复合偶联体的FTIR表征对比显示与单独的黑冰片荧光碳点FTIR光谱相比复合偶联体的红外光谱中显示出一个不同的吸收峰,1439cm-1处的峰归因于酰胺键(N-C)的伸缩振动,这个特征峰的存在表明了酰胺键(CO-NH)的形成,同时证明了偶联体成功合成。3)在肝癌细胞实验中将制备的黑冰片荧光碳点与复合偶联体分别给药细胞通过倒置荧光显微镜和共聚焦显微镜的观察可以发现黑冰片荧光碳点能够顺利进入细胞在显微镜下可以发出蓝色的荧光,而复合偶联体在对比黑冰片荧光碳点后可以发现偶联体集中在细胞膜表面并未进入细胞内,说明GPC-3抗体与黑冰片荧光碳点的偶联效果非常好并且抗体也很好的保留了其靶向性可以特异性识别肝癌细胞对于肝癌的早期诊断有着非常重要的意义。结论:1)通过过碘酸钠氧化法成功的将黑冰片荧光碳点与GPC-3抗体偶联,制备出了具有靶向性的复合偶联体。2)黑冰片荧光碳点与GPC-3抗体的复合偶联体可以特异性识别肝癌细胞这对于肝癌的早期诊断有着重要意义。
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