研究背景和目的糖尿病是严重危害人类健康的常见病,糖尿病易并发动脉粥样硬化等血管并发症,现已成为糖尿病病人死亡主要原因。一氧化氮(NO)介导的内皮依赖性血管舒张反应降低不仅是糖尿病血管并发症的早期标志,而且在糖尿病血管并发症的发生发展中起重要作用。大量研究证明,内源性一氧化氮合酶(NOS)抑制物一非对称性二甲基精氨酸(ADMA)是导致血管内皮功能不全的重要物质。内源性ADMA主要通过二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)代谢消除,因此DDAH活性是决定体内ADMA含量的关键因素。己知DDAH存在两种亚型-DDAH1和。DDAH2;虽然两种亚型均存在于血管内皮细胞,但前者主要分布于表达神经型NOS的组织,后者则主要分布于表达内皮型NOS的心血管组织。有研究表明,当血管壁DDAH活性下降时,DDAH1的表达并没有明显改变,由此提示:在内皮细胞的ADMA代谢中,DDAH2较DDAH1可能起着更为重要的作用。因此,本课题拟在链佐星诱导的糖尿病大鼠模型和高糖孵育培养的ECV304细胞:观察高糖血症对血管组织、细胞DDAH/ADMA/NOS/NO通路的损害;探讨体外DDAH2基因转移能否增加DDAH活性,降低内源性ADMA含量,逆转糖尿病血管内皮依赖性舒张功能不全和高糖对细胞NO合成的损害;并比较研究抗氧化剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)能否保护DDAH活性、逆转高糖血症对DDAH/ADMA/NOS/NO通路的损害;从而阐明DDAH2在糖尿病血管并发症形成过程中的重要作用。为其临床防治及药物开发拓开新的思路,为糖尿病血管内皮功能不全的基因治疗提供可靠的实验依据。 方法①给雄性SD大鼠(体重210±10g)一次性腹腔注射链佐星(STZ 60 mg/kg)制备糖尿病大鼠模型,治疗组大鼠在糖尿病模型成立后从饮水中给予PDTC(10m/kg/d)治疗8周,检测正常对照组、糖尿病组、糖尿病+PDTC治疗组和PDTC对照组大鼠血糖、血脂水平及胸主动脉形态改变,同时检测血管组织DDAH2表达及DDAH活性、血清ADMA含量和离体胸主动脉环内皮依赖性舒张反应。②用重组hDDAt{2腺病毒(1.5×10<10>virus/ml)体外转染正常大鼠和糖尿病大鼠的胸主动脉环,并检测血管组织DDAH2表达、DDAH活性以及血管环内皮依赖性舒张功能，观察DDAH2过表达能否改善糖尿病大鼠的血管内皮功能不全。③分别用30mmol／L葡萄糖孵育正常ECV304细胞、转DDAH2基因的ECV304(pcDNA3.1-DDAH2)、转空载体的ECV304细胞(pcDNA3.1)72 h。检测细胞DDAH1和DDAH2表达、DDAH和NOS活性以及培基中ADMA和NO含量，观察DDAH2过表达是否能逆 转高糖对细胞中DDAH／ADOS／NO通路的损害。 结果 ①糖尿病大鼠血糖和血脂明显升高，而血管组织DDAH活性明显降低(0.052±0.003 vs 0.098±0.010 U／g pro，P<0.01 vs Con)，并伴随着血中ADMA浓度显著升高(2.18±0.23 vs 1.14±0.12，μmol／L，P<0.01 vs Con)和胸主动脉内皮依赖性舒张反应降低(52±2.3％vs 94±1.8％，P<0.01 vs Con)，半数有效浓度(EC<,50>)升高(239.64±20.00 vs 88.38±8.79nmol／L， P<0.Olvs Con)，表明血管内皮功能受损。抗氧化剂PDTC治疗8周后，不仅降低血糖，而且保护血管DDAH活性，阻止内源性ADMA升高，改善糖尿病大鼠血管内皮功能不全。②用重组hDDAH2腺病毒体外转染糖尿病大鼠的离体胸主动脉环后，经RT-PCR可检测到人的DDAH2 mRNA在血管组织表达，其DDAH活性明显高于未转染组和AdSCMVβ-gal腺病毒转染对照组(0.220±0.020 vs 0.057±0.006 vs 0.055±0.008U／g pro，all P<0.01)，并改 善转染血管环的内皮依赖性舒张反应，表现为血管环对乙酰胆碱诱导的最大舒张反应较未转染的糖尿病大鼠血管环显著升高(85±1.7％ vs 54±1.2％，P<0.01，P<0.01 vs untransfected diabetic aortas)，EC<,50>降低(119.46±6.76 vs 248.74_±10.67 nmol／L，P<0.01 vs untransfected diabetic aortas)。而用相同滴度的重组Ad5CMVβ-gal腺病毒转染糖尿病组大鼠胸主动脉环，却不能改善其内皮依赖性舒张功能障碍。用同样滴度的重组hDDAH2腺病毒感染正常对照组大鼠的胸主动脉环，虽然血管环对乙酰胆碱的最大舒张反应没有改变，但对低浓度的乙酰胆碱反应性更加敏感，即ECS0明显降低，(76.68±8.17 vsl32.68±20.029 nmol／L，P<0.05 vs untransfected control aortas)。说明腺病毒介导的hDDAH2基因体外转染能够增加DDAH活性，逆转糖尿病血管内皮不全。③用30mmol／L葡萄糖孵育细胞72 h后，DDAH2表达明显降低，但DDAHl表达无明显改变，细胞DDAH活性也降低(0.37±0.03 vs 0.71±0.03 U／g pro,P<0.01 vs Con)，培基中ADMA含量升高，细胞NOS活性亦降低，导致N0生成减少(35.83±3.07 vs 54.98±1.51，P<0.01 vs Con)。DDAH2 过表达可逆转高糖对细胞DDAH／ADMA／NOS／NO通路的损害。 结论①本研究首次将重组hDDAH2腺病毒导入糖尿病大鼠的离体血管，不仅能够上调血管组织中DDAH2表达和DDAH活性，而且能逆转糖尿病血管的内皮依赖性舒张功能不全；②抗氧化剂PDTC能够保护糖尿病大鼠血管DDAH活性，降低内源性ADMA蓄积，改善糖尿病血管内皮功能不全；③本研究还揭示高糖降低ECV304细胞DDAH活性、增加ADMA蓄积、抑制NOS活性及NO生成是通过降低DDAH2表达，而非DDAH1；并首次研究发现DDAH2过表可逆转高糖对细胞DDAH／ADMA／NOS／NO通路的这些损害作用，证明在内皮细胞中。DDAH活性和ADMA代谢主要由DDAH2，而不是DDAHl基因表达来调节；④综上，本研究在糖尿病大鼠的整体、离体血管、高糖孵育的细胞等多个水平，通过转基因使：DDAH2过表达或抗氧化剂保护DDAH活性等途径，证实了DDAH2表达和DDAH活性降低是糖尿病时内源性ADMA升高和内皮功能不全的重要原因，为阐明糖尿病血管并发症的发病机制和开拓糖尿病血管内皮功能不全防治的新途径奠定了重要的理论和实验基础。