论文部分内容阅读
目的:克隆大肠杆菌锰超氧化物歧化酶基因(sodA)并在保加利亚乳杆菌(L6032)中表达,为下一步SOD发酵奶的研制奠定基础。同时,观察SOD在保加利亚乳杆菌中的活性表达对该菌氧耐受性的影响。方法:1).根据PubMed基因库中报道的大肠杆菌MG1655全基因组DNA序列中SOD的编码基因序列设计引物,PCR扩增大肠杆菌锰超氧化物歧化酶基因,并将其克隆入乳酸菌表达载体pMG36e中组成重组质粒pMG36e-sod。2).对影响L6032电转化效率的多种因素进行初步探讨,优化该菌的电转化条件,并在此条件下将重组质粒pMG36e-sod电转入L6032中。用黄嘌呤氧化酶法对SOD的表达活性进行测定。同时,对保加利亚乳杆菌及其转化子在有氧条件下的存活情况及其在MRS平板上的生长情况进行比较,初步探讨SOD在L6032中的活性表达对其氧耐受性的影响。<WP=8>结果:1).构建了重组质粒pMG36e-sod,经酶切鉴定和PCR鉴定与预期大小完全吻合。核酸序列测定显示插入的sodA片段能正确编码SOD氨基酸序列。2).建立了较优化的电转化条件。在电场强度9kV/cm、电阻100Ω、细菌生长浓度OD600为0.7的条件下,采用pH6.0的柠檬酸盐缓冲液能获得103个转化子/ugDNA的转化效率。3).利用电转化成功地将重组质粒pMG36e-sod导入L6032中。用黄嘌呤氧化酶法测得SOD的表达活性约590.5 NU/mg prot。SOD的活性表达,能增强保加利亚乳杆菌对氧的耐受性,在有氧条件下培养相同时间,重组子在MRS平板上的生长优于原菌,形成的菌落也较大;在有氧条件下存放7-10天,重组子的存活率与原菌相比得到明显提高。结论:SodA在保加利亚乳杆菌中获得了成功表达,增强了该菌对氧的耐受性,有利于该菌的开发应用。同时也为下一步SOD发酵奶的研制奠定了基础。