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抗生素是治疗细菌感染最有效的药物之一。然而,抗生素的过度使用加剧了耐药细菌的产生,使得原本有效的抗生素失去其治疗效果。耐药细菌产生耐药性的重要机理之一是表达β-内酰胺酶（β-lactamases,βLs）,βLs几乎可以水解所有的β-内酰胺类抗生素,如青霉素类,头孢菌素类,碳氢酶烯类抗生素。目前,已经研发了可用于临床的丝氨酸β-内酰胺酶（Serineβ-lactamases,SβLs）抑制剂,如克拉维酸,舒巴坦,他唑巴坦等。由于金属β-内酰胺酶（metalloβ-lactamases,MβLs）变异快速,至今研发MβLs抑制剂仍然存在着很大的困难。因此,开发有效的MβLs抑制剂,建立快速、实时监测MβLs活性及其抑制的方法成为抗生素耐药研究的热点问题,这些研究对于耐药细菌的诊断及其抑制具有重要的理论意义及应用价值。基于此,本研究的主要内容如下:1.获得高纯度的MβLs,研究MβLs抑制剂并探究其抑制机理是应对抗生素耐药问题的理想策略。为了开发广谱型MβLs抑制剂并揭示其抑制机理,在本工作中,首先成功地表达、纯化了三个不同亚族的六种MβLs:包括NDM-1,VIM-2,IMP-1,Bla2,ImiS和L1,其纯度达到95%以上。其中的四种酶（MβLs NDM-1,IMP-1,ImiS和L1）对9个氨基酸硫酯类化合物进行抑制活性评价,结果显示,其IC50值在0.02-54.9μM之间,具有广谱的抑制效果。抑制剂1、5和9协同抗生素对表达ImiS,L1,IMP-1和NDM-1的耐药大肠杆菌均具有良好的抑菌效果,使得抗生素的活性提高了2-32倍。对其抑制机理研究发现,硫酯类化合物与其水解产物共同抑制MβLs;分子对接结果表明,抑制剂1通过其羧基与靶蛋白的Zn（II）离子键合,而其他基团则主要与蛋白的保守氨基酸残基Lys224（NDM-1,IMP-1,ImiS）或Ser221（L1）作用。2.基于等温滴定微量热技术（isothermal titration calorimetry,ITC）研究酶促动力学中酶与底物的特异性反应过程中吸收或释放热量的原理,测定了MβLs（NDM-1和L1酶）及表达MβLs耐药细菌水解头孢唑林的热流曲线,结果表明,利用ITC可实现表达MβLs耐药细菌水解抗生素的监测,并依据其释放热量的变化筛选耐药细菌的底物谱。在活细菌环境中,ITC测定的NDM-1的抑制剂EDTA、D-captopril、依布硒、唑基硫代乙酰胺的抑制活性,其IC50值与UV-Vis和体内NMR的结果一致,分别为3.3,42.8,0.5和17.6μM。同时,为了进一步验证ITC在细菌活细胞内评价MβLs抑制活性的可行性,测定了L1的抑制剂（巯基乙酸,氨基酸硫酯和罗丹宁）的抑制活性,其结果也表明IC50值与UV-Vis的测定结果一致。此外,通过测定抑制反应的总热量Q总能够识别抑制类型,Q总不变时,为可逆抑制剂,Q总减小时,为不可逆抑制剂。最后,不同来源的临床耐药细菌水解抗生素的Q总与其最低抑制浓度（MIC）一致。以上结果表明,成功地建立一种ITC监测耐药细菌细胞内MβLs活性及其抑制的新方法。3.反义寡聚核苷酸（antisense oligonucleotides,ASO）能够靶向阻断特定基因的表达,具有快速设计与合成的特点而被用于药物的研发。在本工作中,设计并合成了靶向NDM-1 mRNA的全硫代修饰PS-ODN;同时,建立了一步制备PLGA-PEI纳米粒子的方法,动态光散射、扫描电镜和红外光谱分析证明成功地制备了带有正电荷的PLGA-PEI纳米粒子。所得的纳米粒子可以与带有负电荷的PS-ODN有效地结合,通过调节PLGA-PEI与PS-ODN的比例,纳米粒子的包封率达到95%以上。PLGA-PEI/PS-ODN反义纳米粒子与抗生素协同抑制表达NDM-1的耐药细菌时,展现出优良的抑菌效果,当PS-ODN浓度大于7μg/mL时,亚胺培南的活性提高了4-8倍,并表现出浓度依赖型的抑制方式,而PLGA-PEI/PS-ODN本身没有抗菌活性。Blue-Carba和实时荧光定量PCR结果进一步揭示,反义纳米粒子协同抗生素抑菌的作用机制是从转录水平抑制NDM-1的表达,当反义纳米粒子的浓度为28μg/mL时,NDM-1的表达量为正常表达量的15%。以上结果为应用反义寡聚核苷酸治疗耐药细菌感染提供了新的思路。