卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer, EOC,以下简称卵巢癌),恶性程度高,在妇科恶性肿瘤中死亡率最高,多数患者发现时已是晚期,晚期卵巢癌患者五年生存率仅30%,如能早期发现有效治疗,五年生存率高达90%。临床亟需新的卵巢癌肿瘤标记物和新治疗方法。间皮素(Mesothelin, MSLN)是一种新发现的肿瘤细胞表面抗原,通常仅表达在体腔表面的间皮细胞,在恶性胸膜间皮瘤、胰腺癌和卵巢癌等恶性肿瘤中过表达。间皮素有两个异构体,其中一个可以从细胞表面脱落入血,称可溶性间皮素相关蛋白(soluble mesothelin related peptides/proteins, SMRP)。由于SMRP可以释放入血且分子量明显低于常用的卵巢癌肿瘤标记物CA125,所以,理论上敏感性要高于CA125,而且在恶性间皮瘤中血清SMRP升高,因此,组织中同样高表达间皮素的卵巢癌患者血清中SMRP也有可能升高,从而有望成为卵巢癌诊断的标记物。间皮素可以增强多种恶性肿瘤细胞的增殖、粘附能力,但是其确切机制还不为人知。鉴于间皮素在包括卵巢癌在内的少数几种癌组织中高表达,而在正常间皮组织不表达或者低表达的特点,我们推测：间皮素可能与卵巢癌的肿瘤发生形成、腹腔转移等多个环节有关,正因如此,间皮素有望成为生物卵巢癌靶向治疗的优质靶点。详细了解间皮素的作用机制,将为卵巢癌的诊断、控制腹腔转移和新疗法的提出提供强有力的理论依据。在肿瘤的发生形成过程中,细胞的锚定依赖生长(anchorage-dependent growth)能力和非锚定依赖生长(anchorage-independent growth)能力是代表肿瘤增殖能力的两个重要方面。锚定依赖生长指细胞的生长依赖细胞与细胞之间和细胞与细胞外基质(ECM)之间的信号传递。非锚定依赖生长能力指细胞失去与细胞和ECM之间的信号传递后仍能生长增殖。非锚定依赖生长能力增强是恶性肿瘤生长特性和发生转移的条件之一。细胞周期是调控细胞生长增殖过程中的关键环节,其失控是发生肿瘤的重要原因之一,在对细胞周期的调控过程中,细胞周期蛋白(cyclin)和细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)是关键物质,两者结合成为二聚体后激活CDK从而启动细胞周期,并促进细胞周期中不同实相的转换。Cyclin D1是细胞周期蛋白中非常重要的一分子,对细胞周期起正向调控作用,在多种肿瘤组织中过表达,被认为与多种肿瘤的发生相关。失巢凋亡是细胞凋亡中的一种特殊类型,是指细胞在脱离原来生存环境的特殊情况下发生的凋亡。恶性肿瘤细胞往往具有很强的抗失巢凋亡的特性,从瘤体上脱落后并不发生凋亡,从而发生转移。抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡前体蛋白Bim是在细胞凋亡过程中作用相反的两个调节因子。本课题拟首先研究血清SMRP在卵巢癌诊断和病情监测中的应用价值,对其诊断效能进行评价；然后在细胞水平对间皮素的生物学功能进行研究,分为间皮素对细胞锚定依赖生长能力、非锚定依赖生长能力、细胞周期和失巢凋亡四个方面的影响,通过cyclin D1、Bcl-2及Bim的变化,进而从分子水平分析间皮素的作用机制；在体内水平,利用卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型,观察间皮素RNAi慢病毒液对卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤的基因治疗作用,并对裸鼠移植瘤标本进行细胞周期和细胞凋亡检测,探讨间皮素在卵巢癌基因靶向治疗中的作用机制。第一部分血清SMRP在上皮性卵巢癌诊断和病情监测中的价值目的：检测卵巢癌、卵巢良性肿瘤及健康志愿者三组人群血清SMRP,对卵巢癌患者不同病理类型、不同临床分期、不同病理分级血清SMRP水平进行对比分析。对接受肿瘤细胞减灭术的卵巢癌患者术前术后血清SMRP水平进行对比分析。同时检测同源血清标本中CA125的水平,与血清SMRP水平进行比较及相关性分析,对间皮素作为卵巢癌早期诊断血清肿瘤标志物做诊断效能评价。方法：用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法定量检测56例卵巢癌、38例卵巢良性肿瘤和34例健康志愿者的血清SMRP水平；对56例卵巢癌患者中的23例进行了术前术后的血清SMRP比较,判断其能否作为卵巢癌早期诊断和病情监测的指标,并计算出其诊断标准,从敏感性和特异性等多方面对其进行诊断效能评价。采用瑞典康乃格(ConAg)公司生产的MESOMARK试剂盒,应用双抗夹心ELISA法检测血清中SMRP含量。各组血清CA125浓度均由核医学科化学发光法常规测得。之后应用SPSS13.0统计学分析软件进行统计学处理,分别进行组间计量资料比较、组间计数资料比较、诊断效能评价分析、相关性分析。结果：1.卵巢癌组(组1)、卵巢良性肿瘤组(组2)、健康体检者组(组3)组间比较：组1外周血清间皮素水平明显高于组2(Wilcoxon秩和检验统计量z=6.973,P<0.001)及组3(z=7.153,P<0.001),差异有统计学意义。组2与组3血清间皮素水平接近,其差异无统计学意义(z=1.895,P=0.058>0.05)。2.卵巢癌组不同病理类型间血清间皮素水平比较：浆液性癌组、粘液性癌组、子宫内膜样癌组外周血清间皮素水平比较采用多样本秩和检验,K-W检定方法(Kruskal-Wallis H Test),z2=5.736,P=0.057>0.05,其差异无统计学意义。3.卵巢癌组不同手术-病理分期血清间皮素水平比较：分期依据卵巢恶性肿瘤临床手术病理分期FIGO2000。卵巢癌Ⅱ-Ⅳ期组血清间皮素水平显著高于Ⅰ期组(Wilcoxon秩和检验统计量z=3.184,P=0.001<0.05),差异有统计学意义。4.卵巢癌组不同分化等级间血清间皮素水平比较：分化等级G1级(高分化)、G2级(中分化)、G3级(低分化)三组血清间皮素水平差异有统计学意义,K-W检定方法,χ2=26.221,P=0.000<0.05,分化越低,血清间皮素含量越高。5.卵巢良性肿瘤组不同病理类型间血清间皮素水平采用多样本秩和检验,K-W检定方法,χ2=6.948,P=0.225>0.05,其差异无统计学意义,尚不能认为卵巢良性肿瘤六种不同病理类型组间的血清SMRP水平分布有差异。6.卵巢癌术前术后血清间皮素比较：56例卵巢癌中的23例接受了肿瘤细胞减灭术的患者,术后1周血清间皮素较术前降低,采用独立样本秩和检验,z=5.129,P=0.000<0.05,差异有统计学意义。7.血清间皮素水平对卵巢肿瘤的诊断价值：SPSS13.0统计软件ROC曲线分析显示其诊断正确度较高。(以术后病理诊断为诊断金标准,卵巢癌组56例为病例组,其余卵巢良性肿瘤38例和健康志愿者34例合计72例为对照组)ROC曲线下面积(area under the ROC curve, AUC)为0.938,标准误为0.026,其95%的近似置信参考区间为(0.888-0.988)。8.血清SMRP对卵巢癌诊断标准如下：当血清间皮素≥1.6432nM时被诊断为阳性,即异常；当血清间皮素<1.6432nM时被诊断为阴性,即正常。此时敏感性(sensitivity)=0.7941,特异性(specificity)=1。9.血清间皮素与CA125对卵巢肿瘤患者诊断价值的比较(以术后病理诊断为诊断金标准,卵巢癌组56为病例组,38例卵巢良性肿瘤为对照组。血清间皮素≥1.6432nM诊断为阳性；<1.6432nM为阴性。血清CA125≥35.0u/ml诊断为阳性；<35.0u/ml为阴性)。间皮素ROC曲线AUC为0.925,CA125ROC曲线AUC为0.941。二者诊断正确度均较高。血清SMRP检测特异度(Sp)、漏诊率(β)、阳性预测值(PV+)、正确率(π)、Youden指数(YI)较CA125高；灵敏度(Se)稍低接近；误诊率(α)低,阴性预测值(PV一)稍低。10.血清间皮素水平与血清CA125水平相关性分析：应用Spearman秩相关分析,P=0.334>0.05,表明血清间皮素与CA125水平无相关关系。11.联合血清间皮素与CA125进行诊断效能分析,联合敏感度为97.9%,联合特异度为81.6%,与单独应用血清间皮素或CA125相比,敏感性提高。结论：1.卵巢癌患者血清中间皮素水平：应用ELISA双抗体夹心法测定,卵巢癌患者血清中间皮素水平明显高于卵巢良性病变患者及健康女性。卵巢癌患者血清间皮素水平与卵巢癌临床病理分期、分化程度有关。2.血清间皮素诊断卵巢癌有较高的特异性及敏感性,对卵巢癌与卵巢良性肿瘤鉴别诊断的特异性较CA125高,临床诊断效能较好。有望成为新的卵巢癌血清肿瘤标志物用于临床检测以助提高卵巢癌的早诊率。3.接受了理想的肿瘤细胞减灭术的卵巢癌患者术后血清间皮素较术前显著降低。血清间皮素作为卵巢癌治疗效果评价、病情监测指标也具有可行性。第二部分间皮素对卵巢癌细胞增殖和细胞周期的影响及其机制研究目的：观察间皮素对卵巢癌细胞锚定依赖生长能力和非锚定依赖生长能力的影响,从细胞周期的角度分析间皮素影响细胞增殖和生长能力的机制,同时检测沉默间皮素后细胞周期蛋白cyclin D1的变化情况,从分子水平探讨间皮素影响细胞周期的途径。方法：1.分别用LV-MSLN-neg(LV-MSLN-negative,空载体慢病毒液)、LV-MSLN-RNAi(间皮素RNAi慢病毒液)转染SKOV3细胞,转染96h后激光共聚焦显微镜下观察荧光表达,计算转染效率,了解LV-MSLN-RNAi转染对SKOV3细胞的间皮素基因沉默效果。两种慢病毒液转染的细胞分别表示为：SKOV3-MSLN-RNAi(实验组,干扰组)和SKOV3-MSLN-neg(阴性对照组),SKOV3作为空白对照组。2.利用Western blot检测两种慢病毒液转染细胞后,将SKOV3-MSLN-neg、SKOV3-MSLN-RNAi与SKOV3细胞中间皮素蛋白的表达进行比较,计算干扰效率,验证慢病毒液转染后间皮素蛋白的变化情况,了解转染后的细胞是否满足后续实验要求。3.应用台盼蓝染色计数方法检测间皮素沉默对SKOV3细胞增殖能力的影响,平板克隆形成实验检测细胞锚定依赖生长能力,软琼脂克隆形成实验检测细胞非锚定依赖生长能力的改变。4. SKOV3-MSLN-neg、SKOV3-MSLN-RNAi和SKOV3细胞贴壁生长24h后,用不含胎牛血清的1640培养基饥饿培养24h,更换为含10%胎牛血清1640培养基,继续培养24h后收集细胞,利用流式细胞术检测细胞周期,分析沉默间皮素对SKOV3细胞周期的影响。5.western blot方法测定沉默间皮素对细胞周期蛋白cyclin D1的表达影响,以进一步探讨间皮素影响细胞周期的作用机制：SKOV3-MSLN-neg、SKOV3-MSLN-RNAi和SKOV3细胞生长至亚融合状态后,提取细胞总蛋白,利用western blot检测cyclin D1的表达情况。为动态观察cyclin D1的变化,SKOV3-MSLN-neg、SKOV3-MSLN-RNAi和SKOV3细胞用不含胎牛血清的1640培养基饥饿培养24h,更换为含2%胎牛血清的1640培养基,分别于培养0、2、4、6h提取细胞总蛋白,利用western blot检测cyclin D1的表达情况。结果：1.慢病毒转染SKOV3细胞96h后,激光共聚焦显微镜下观察转染细胞中荧光细胞的数量,证实慢病毒液对细胞的转染效率为80%-90%,满足后续试验要求。2. Western blot结果显示,RNAi慢病毒液转染SKOV3细胞后,SKOV3-MSLN-RNAi间皮素蛋白的表达被有效沉默,其干扰效率可以达到90%,空载体慢病毒液转染的细胞SKOV3-MSLN-neg间皮素的表达没有改变。3.台盼蓝染色细胞计数法测定的细胞增殖情况：实验组(即干扰组SKOV3-MSLN-RNAi,阴性对照组(SKOV3-MSLN-neg)和空白对照组(SKOV3)的细胞个数分别为(9.89±2.0)×105,(18.9±2.24)×105,(19.81±2.5)×105,结果比较差异有统计学意义(F=29.76,P<0.05)。干扰组细胞增殖速度显著慢于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),阴性对照组和空白对照组之间增殖速度无明显差别(P=0.531)。4.平板克隆形成实验结果显示,实验组克隆形成率为(15.85±2.5)%,阴性对照组为(28.3±2.7)%,空白对照组为(29.13±1.98)%,结果比较差异有统计学意义(F=47.62,P<0.05)。实验组细胞克隆形成率明显低于其他两组(P<0.05),阴性对照组和空白对照组之间克隆形成率无明显差别(P=0.612)。5.软琼脂克隆形成实验结果：实验组克隆形成率为(8.38±0.82)%,阴性对照组为(19.13±0.67)%,空白对照组为(18.38±0.50)%,结果比较差异有统计学意义(F=78.98,P<0.05)。实验组细胞克隆形成率明显低于其他两组(P<0.05),阴性对照组和空白对照组之间克隆形成率无明显差别P=0.441)。6.流式细胞术检测的细胞周期在实验组细胞：G1期(88.53±1.41)%,S期(7.35±0.57)%,在空白对照组G1期(66.69±2.00)%,S期(20.78±2.67)%,阴性对照组G1期(66.31±1.65)%,S期(20.88±2.64)%。干扰组细胞S期细胞比例明显低于其他两组(F=154.282,P<0.05),阴性对照组和空白对照组之间S期细胞比例无明显差别(P=0.913)。7. cyclin D1在三组细胞中的表达在常规培养的三组细胞中,cyclin D1的表达通过测定灰度值(OD值)计算得到各组间的相对蛋白值分别为：干扰组0.042±0.006,空白对照组0.917±0.226,阴性对照组0.884±0.252。干扰组、空白对照、阴性对照组的平均秩次分别为5、17.33和19.67。Chi-Square统计量为17.784,P=0.000<0.05,三组细胞中cyclin D1的表达不同,干扰组细胞cyclin D1的表达低于其他两组,空白对照组和阴性对照组cyclin D1表达无统计学差异(Z=-0.929,P=0.387)。接下来对三组细胞饥饿培养24h后加入2%血清后不同时间点cyclinD1表达量的检测提示：空白对照组0、2、4、6h的cyclin D1蛋白值为0.191土0.119、0.528±0.027、0.941±0.018、0.036±0.006；阴性对照组0、2、4、6h的cyclin D1蛋白值为0.188±0.116、0.545±0.032、0.926±0.015、0.036±0.007；在干扰组cyclin D1在0、2、4、6h的蛋白值分别为0.006±0.001、0.187±0.006、0.387±0.018、0.639±0.037。分别对三组细胞中cyclin D1在四个时间点的表达进行统计学分析,在加入血清后0、2、4 h干扰组中的表达均低于另外两组,而在加入血清后6h,干扰组中的表达高于另外两组,差异均有统计学意义。结论：1.间皮素可以同时增强卵巢癌细胞SKOV3的锚定依赖生长和非锚定依赖生长能力,下调细胞表面间皮素的表达可以降低这两种能力。2.间皮素可以影响卵巢癌细胞SKOV3的细胞周期,促进细胞进入S期。3.间皮素影响卵巢癌细胞SKOV3细胞周期,可能是通过增加或者提前合成cyclin D1而实现。第三部分间皮素对卵巢癌细胞失巢凋亡的影响及其机制研究目的：观察间皮素对卵巢癌细胞SKOV3失巢凋亡的影响,从抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡前体蛋白Bim的改变来分析间皮素影响细胞凋亡的详细作用机制。方法：1.慢病毒转染SKOV3细胞(同第二部分)。2.细胞失巢凋亡的检测：聚-HEMA(Poly-hema)是一种阴离子聚合物,铺在细胞培养皿底部可以阻止细胞贴壁,用10g/l的聚-HEMA铺在培养皿底部,每次2ml,共铺2次。在接种细胞之前,用PBS冲洗3遍。将SKOV3-MSLN-neg、SKOV3-MSLN-RNAi和SKOV3细胞以3×105个细胞/cm2分别种植于聚.-HEMA包被的培养板上,培养72h后,收集细胞,用流式细胞术检测细胞凋亡情况。3.在失巢凋亡模型中培养72h的细胞,收集细胞,提取细胞总蛋白,用western blot方法检测抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡前体蛋白Bim的表达。结果：1.流式细胞术检测细胞失巢凋亡情况：正常悬浮培养72 h后实验组细胞凋亡率为(32.197±1.77)%,与空白对照组和阴性对照组细胞的凋亡率(14.93±0.94)%和(15.49±0.91)%相比较,差异有统计学意义(F=80.07,P=0.000<0.05)。空白对照组和阴性对照组细胞的凋亡率比较,差异无统计学意义(P=0.739<0.05)。2. western blot方法检测Bcl-2和Bim蛋白的表达：在聚-HEMA诱导卵巢癌细胞失巢凋亡72h后,干扰组、阴性对照组和空白对照组的细胞中Bcl-2蛋白的灰度值为0.712±0.116、0.93±0.025、0.82±0.093,三组细胞中Bcl-2蛋白表达无统计学差异(Chi-Square统计量为2.293,P=0.318)。Bim蛋白的表达灰度值在干扰组细胞、空白对照组和阴性对照组分别为0.982±0.012、0.724±0.025、0.739±0.025,三组细胞中Bim蛋白的表达,差异有统计学意义(Chi-Square统计量为17.646,P=0.00),空白对照组和阴性对照组之间Bim蛋白的表达,差异无统计学意义(P=0.826)。结论：1.间皮素增强卵巢癌细胞SKOV3的抵抗失巢凋亡的能力,沉默细胞表面间皮素表达可以降低抵抗失巢凋亡的能力。2.间皮素增强卵巢癌细胞SKOV3的抵抗失巢凋亡的能力的机制,与低表达凋亡前体蛋白Bim有关,沉默细胞表面间皮素可以通过增加Bim的表达而诱导失巢凋亡。第四部分间皮素在卵巢裸鼠腹腔移植瘤基因治疗中的价值及机制探讨目的：在体内水平验证间皮素RNAi漫病毒液注射对卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤的治疗效果,从移植瘤组织的细胞周期和细胞凋亡两个方面分析间皮素发挥基因治疗作用的机制。为检测慢病毒用于基因治疗的安全性,对裸鼠注射慢病毒后的毒性试验进行初步研究。方法：1.裸鼠卵巢癌腹腔移植瘤模型的建立：雌性BALB/C裸小鼠,4-6周龄,体重13.5-16.5g在清洁级(SPF级)环境中,常规收取SKOV3制备细胞悬液5×107个细胞/ml。抽取0.2ml细胞悬液(1×107个)注射在裸鼠腹腔内。2.间皮素RNAi慢病毒液对裸鼠卵巢癌腹腔移植瘤的基因治疗效果：裸鼠随机分成3组,慢病毒液LV-MSLN-neg组、]LV-MSLN-RNAi组和空白对照PBS组,每组5只,卵巢癌细胞SKOV3分别和PBS及间皮素RNAi慢病毒液同时裸鼠腹腔内注射,后续隔日注射慢病毒液及PBS,14天后观察成瘤情况。3.间皮素RNAi慢病毒对裸鼠腹腔移植瘤中间皮素的干扰效果：处死裸鼠的同时,留取移植瘤组织,提取组织蛋白,利用western blot检测组织中间皮素被干扰的情况。4.流式细胞术检测裸鼠腹腔移植瘤标本的细胞周期和细胞凋亡：处死裸鼠,留取移植瘤组织,生理盐水冲洗2遍,70%的冷乙醇固定,制备单细胞悬液后上机检测。5.慢病毒毒性试验：裸鼠随机分成3组,每组5只,实验组腹腔内分别注射相同剂量慢病毒液LV-MSLN-RNAi、LV-MSLN-neg,对照组注射PBS,3周后测量体重差并处死裸鼠,肉眼及病理学HE染色检查慢病毒毒性试验中裸鼠心、肝、脾、肾等重要脏器有无改变。结果：1.间皮素RNAi’慢病毒液对裸鼠腹腔移植瘤的基因治疗作用：阴性对照组和空白对照组裸鼠均在接种7天左右开始出现体重明显增加,实验组体重正常增加。治疗14天后处死荷瘤裸鼠,三个组的腹腔移植瘤成瘤率无统计学差异(P=0.222>0.05),而实验组的瘤体重量(F=43.2,P<0.05)、肿瘤数目(F=31.13,P<0.05)、肿瘤分布部位数(F=44.98,P<0.05)均明显低于其他两组,差异有统计学意义。阴性对照组和空白对照组的移植瘤生长情况无明显差异。2.间皮素RNAi慢病毒液对裸鼠腹腔移植瘤中间皮素的基因沉默作用：Western blot结果显示,多次慢病毒注射治疗荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤实验中慢病毒液凋亡抑制基因治疗组、LV-MSLN-neg空载体对照组与空白对照PBS组相比较对MLSN基因的干扰效率分别为75.6%和8.9%,实验组与其他两组比较,差异有统计学意义P<0.05)。3.流式细胞术检测裸鼠移植瘤组织细胞周期：实验组的细胞周期分布为：G1期(80.78±0.64)%,S期(11.20±0.71)%,空白对照组的细胞周期分布：G1期(60.13±2.32)%,S期(33.19±2.01)%,阴性对照组的细胞周期分布：G1期(58.74±1.50)%,S期(31.89±2.16)%。实验组细胞S期细胞比例明显低于其他两组(F=154.282,P<0.05),阴性对照组和空白对照组之间S期细胞比例无明显差别(P=0.913)。4.流式细胞术检测移植瘤组织细胞凋亡情况：实验组移植瘤组织中细胞的凋亡率为(29.49±1.7)%,空白对照组凋亡率为(17.41±1.52)%,阴性对照组的凋亡率为(21.50±1.19)%。实验组与其他两组凋亡率比较,差异有统计学意义(F=11.972,P=0.000<0.05)。空白对照组和阴性对照组比较,差异无统计学意义(P=0.165)。5.慢病毒液毒性试验结果：腹腔内分别注射相同剂量慢病毒液LV-MSLN-RNAi及LV-MSLN-neg的裸鼠3周后体重差(1.44±0.34,1.64±0.29)与空白对照PBS组(1.43±0.43)比较,差异无统计学意义((F=10.35,P>0.05),裸鼠一般状况良好,饮食及活动正常,未发现明显的全身毒副作用。21天后处死裸鼠,各器官均未发现明显的肉眼病理改变,取心、肝、脾、肾做病理学HE染色镜下观察,均未见明显病理改变。结论：1.卵巢癌细胞SKOV3在腹腔内的种植、转移受到间皮素的影响,通过间皮素RNAi慢病毒的基因治疗减少了卵巢癌腹腔移植瘤中间皮素的表达,从而对卵巢癌细胞的种植、转移起到了一定的抑制作用,裸鼠动物体内实验证明间皮素基因沉默治疗有效。2.间皮素RNAi慢病毒通过抑制细胞周期进展和促进细胞凋亡而起到对卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤的治疗作用。3.慢病毒治疗对实验动物未见明显的毒性,是一种比较安全可靠的.治疗方法。