神经元凋亡在神经系统发生、发育过程中发挥着重要作用，而且越来越多的证据表明神经元凋亡是形成神经退行性疾病的机制之一。因此，阐明神经元凋亡机制对于发现神经性疾病病因和明确治疗靶点有非常重要的意义。 小脑颗粒神经元(CGNs)是哺乳动物脑中丰富的中枢神经元。体外培养CGNs时，胞外25mM KCl(高钾)可使神经元处于去极化状态，维持小脑颗粒神经元的分化、成熟和存活，而去血清、复极化浓度的KCl(5mM，低钾)培养基可诱导分化成熟的小脑颗粒神经元凋亡。由于小脑颗粒神经元来源丰富、体外培养的同质性高，所以此凋亡模型已被广泛应用于中枢神经元凋亡机制的研究。 大量研究表明，JNK/c-Jun通路的激活在神经元凋亡过程中发挥了重要作用。低钾处理小脑颗粒神经元、撤NGF处理的交感神经元、D淀粉样蛋白处理大脑皮质神经元等凋亡模型中，都已证明JNK的活化是凋亡发生所必需的。c-Jun与ATF2作为JNK重要的下游底物，其活性也伴随磷酸化水平的升高而升高，目前的研究表明，c-Jun与ATF2可以形成转录因子二聚体作用于下游的靶基因，从而发挥促凋亡作用。 c-jun作为AP1蛋白家族需要与其它bZIP结构蛋白形成二聚体才能发挥完整的转录因子功能，而且一直以来围绕着凋亡下游的靶基因是什么，尤其是c．iun这个与凋亡关系比较密切的转录因子的靶基因是什么的问题是近几年国内外研究的热点。然而在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡中，c-Jun与ATF2是否形成了二聚体并没有相关文献予以直接回答，而二者与凋亡之间的关系也没有明确的报道。如果我们能证实在低钾诱导的CGNs凋亡中，c-Jun/ATF2二聚体确实形成并参与了凋亡进程，那么对于以c-Jun/ATF2转录因子二聚体为出发点来寻找下游靶基因具有重要的指导意义。因此，本课题主要探讨以下几个问题： 1．在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡时，c-Jun与ATF2活性是否增加； 2．在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡时，c-Jun与ATF2是否形成了二聚体； 3．c-Jun与ATF2二聚体的形成是否是神经元凋亡所必须的。 结果 1．低钾(5mM KCl)诱导小脑颗粒神经元凋亡模型时c-Jun与ATF2的活性变化小脑颗粒神经元体外培养第7天，分别用25mM KCl(25K)或5mM KCl(5K)培养基处理0.5、1、2、4h。收集蛋白后用Western Blot方法检测发现，低钾处理时，ATF2的69与71位苏氨酸磷酸化水平从0.5h开始增加，2h达到峰值，然后逐渐下降，而ATF2的转录活性增强，是69/71位苏氨酸磷酸化依赖的；同时我们用c-Jun磷酸化抗体(Ser73)检测c-Jun磷酸化水平的变化，发现c-Jun磷酸化水平在低钾0.5h后同样显著增加，2h达到最高，c-Jun Ser63，Ser73位点的磷酸化同样能增加c-Jun转录活性。这说明神经元凋亡时，c-Jun与ATF2的磷酸化水平增加，转录活性增加。 2．低钾(5mM KCl)诱导小脑颗粒神经元凋亡模型时c-Jun与ATF2形成二聚体c-Jun与ATF2同属于碱性-亮氨酸拉链(basic leucine zipper，bZip)蛋白成员，已有的研究表明，c-Jun与ATF2可以形成二聚体并且特异性与ATF/CRE序列(TTACCTCA或TGACGTCA，下称ATF序列)结合。为此，我们用ATF序列为探针进行了EMSA分析，以获得低钾诱导小脑颗粒神经元凋亡时c-Jun与ATF2形成二聚体的证据。体外培养第7天的神经元分别用25K、5K处理4h，然后收集核蛋白，与γ<'32>p标记的ATF探针孵育后跑胶，干胶后放射自显影。发现ATF探针与核蛋白形成复合物，并且此复合物在5 K处理增加。进一步超飘移实验(supershift assay)来证明复合物中的组分。探针核蛋白孵育时加入c-Jun抗体，发现ATF位点特异复合物明显减少，而在上方出现了一新条带(supershifted band)，表明c-Jun为复合物组分之一。加入ATF2抗体后发现，特异条件减弱，显示ATF2抗体可干预特异复合物的形成，表明ATF2也存在蛋白复合物中。我们的结果显示c-Jun与ATF2都存在结合ATF位点的蛋白质复合物中，强烈提示两者作互作用形成复合体。 3．小分子干扰c-Jun或ATF2对小脑颗粒神经元凋亡和存活的干预作用体外培养第5天的小脑颗粒神经元，用钙磷沉淀法共转染shc-Jun-a，shc-Jun-b或空质粒BS/U6，pEGFP质粒共转染用于标记转染成功的细胞。48h后，换成25K、5K模型。12h后Hoechst 33258(5 g/ml)进行染色显示细胞核形态用于计数凋亡细胞(细胞核固缩或细胞核碎裂)，GFP阳性细胞数计为总数，计算凋亡率。结果显示干扰c-Jun表达后神经元凋亡率大大下降，同样的沉默ATF2也具有保护性干预作用。 4．P12×jun2 decoy质粒对小脑颗粒神经元凋亡和存活的干预作用体外培养第5天的小脑颗粒神经元，用钙磷沉淀法共转染P12×jun2，P12×jun2-mut或空质粒pMD，pEGFP质粒共转染用于标记转染成功的细胞。36h后，换成25K、5K模型。12h后Hoechst 33258(5 ug/ml)进行染色显示细胞核形态用于计数凋亡细胞(细胞核固缩或细胞核碎裂)，GFP阳性细胞数计为总数，计算凋亡率。结果显示P12×jun2组显著的降低5K下的神经元凋亡率，说明P12×jun2decoy质粒能有效的保护低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡。 结论： 1．在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡时，c-Jun与ATF2转录活性增加。 2．转录因子c-Jun与ATF2在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡中形成了二聚体。 3．c-Jun与ATF2二聚体是低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡所必须的。