背景和目的:脓毒症是由感染引起的全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),由其诱发的多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)已成为当今外科ICU患者的首要死亡原因。然而,目前为止,我们对激发脓毒症的细胞及分子机制和脓毒症病人在抵御炎症、维持自稳方面的天然生理机制并不十分清楚,因而对脓毒症病人并无有效的治疗措施。来源于G-菌的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可触发典型的脓毒症。因此,阐明LPS的信号转导机制不仅可深化认识过度炎症反应的发生机制,更重要的是,可望为寻找其新的干预措施提供思路。目前认为,LPS侵入机体后,通过TLR4→MyD88→IRAK→TRAF6→TAK1→MAPK/NF-κB(MyD88依赖)及TRAM-TRIF-RIP-IKKi-IRF3(MyD88非依赖)的信号通路引起炎性介质的释放,另一方面,在LPS启动炎症反应的同时,机体还存在着复杂的炎症反应负向调控网络。这些正向和负向信号通路的平衡调控着炎性基因的表达。但迄今为止,这些通路仍不十分明确。阐明这些正向及负向调控通路对深入了解LPS活化的TLR4信号通路有重要意义,可使LPS诱导的炎性反应受到人为的精细调节,在控制微生物感染的同时保护机体免受致命的损害。近年来,随着信号通路研究的不断深入,众多的细胞内信号调节分子不断地被发现,因而,除目前已知的调控通路外,研究人员仍在试图寻找是否还存在其他的信号调控通路。PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)是1997年发现的一个具有磷酸酶活性的抑癌基因,在细胞分化、衰老、凋亡、粘附和迁移等多种生理活动中发挥重要作用。近年来发现其还参与免疫细胞的发育,信号传递过程和维持正常免疫反应。PTEN具有脂质磷脂酶的活性,其主要功能是使PI(3,4,5)P3的D3位点去磷酸化,从而降低细胞内PIP3的水平。而PIP3是PI3K/Akt通路的关键环节,PIP3的减少可降低PI3K激活引起的Akt磷酸化,进而阻断PI3K/Akt信号通路。由此可见,PTEN是PI3K/Akt信号通路中的一个重要的分子开关。当PTEN活性增强时,PI3K/Akt通路减弱,甚至关闭,而当PTEN活性减弱时,PI3K/Akt通路则增强。同时,作为一个双特异性的磷酸酶,PTEN也兼有蛋白磷酸酶的功能,能使它自身、聚集黏附激酶(focal adhesion kinase,FAK)、SHC和由生长因子受体衍生的血小板脱磷酸,抑制细胞的粘附、迁移和扩散。目前已知,PI3K是介导炎症反应负向调控最关键的激酶之一,而且,与内毒素耐受不同,PI3K在LPS入侵机体后早期即参与了LPS诱导的TLR4信号通路的调节,在机体免疫反应的第一时相即发挥重要的负向调控作用。因此,人们推测,作为PI3K天然的拮抗分子,PTEN是否也参与了LPS所导致的炎症性反应的调控。最新研究显示,LPS刺激后,PTEN(+/+)小鼠的腹腔巨噬细胞MAPK激酶的活性增强,TNF-α等炎症介质的产生和释放明显高于PTEN(-/-)小鼠,提示PTEN在调控炎症反应中的地位非常重要。然而LPS通过何种方式与PTEN发生相互作用而调控炎症反应的发生发展,PTEN又是通过怎样的信号通路介导了炎症介质的释放,目前知之甚少。为此,本研究以RAW264.7细胞株为细胞模型,首先检测了LPS对PTEN表达、活性的影响及PTEN对炎性细胞因子TNF-α分泌的作用,以验证PTEN是否参与了LPS活化的TLR4信号通路及对炎性因子分泌的影响。其次,检测了PTEN对LPS诱导的MAPK及NF-κB活性的影响,以探明PTEN对LPS活化的TLR4信号通路作用的分子机制。然后在此基础上检测了LPS刺激下,PTEN对其下游信号分子Akt磷酸化水平的影响。最后,分析了PTEN与TLR4复合受体的关系,对LPS信号通路中PTEN的上游调控进行了初步探讨。方法:1.采用RAW264.7细胞为细胞模型,收集不同浓度LPS刺激后8、24、48h细胞蛋白,Western Blot法检测PTEN蛋白表达水平;收集LPS (1μg /ml)刺激后0、5、10、20、30、45、60、120min细胞蛋白,Western Blot法检测PTEN磷酸化水平及蛋白含量。2.采用瞬时转染及RNA干扰技术,下调内源性PTEN蛋白表达,分为siRNA-PTEN组及对照的SsiRNA组, LPS刺激6h后收集细胞培养上清以ELISA法检测TNF-α水平;另一部分实验将RAW264.7细胞分为两组,正常细胞组及提前1h加入PTEN抑制剂组,LPS刺激6h后收集细胞培养上清,ELISA法检测TNF-α含量。3. RAW264.7细胞分为过表达野生型PTEN组及空载体组,每组再分为未刺激及LPS(1μg /ml)刺激后15、30min组,收集细胞蛋白,Western Blot法检测p-ERK、p-P38、p-JNK磷酸化水平及总蛋白含量;RAW264.7细胞分为两组,正常细胞组及PTEN抑制剂组,每组再分为未刺激及LPS(1μg/ml)刺激后10、20、30、45、60min组,收集细胞蛋白,Western Blot法检测p-ERK、p-P38、p-JNK磷酸化水平及总蛋白含量。4. RAW264.7细胞分为四组,过表达空载体组、过表达野生型PTEN组、过表达C124A-PTEN组(PTEN蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶活性双突变)、过表达G129E-PTEN (PTEN脂质磷酸酶活性突变)组,LPS刺激6h后双荧光素酶报告基因实验检测NF-κB转录活性;RAW264.7细胞分为siRNA-PTEN组及对照的SsiRNA组,LPS刺激6h后双荧光素酶报告基因实验检测NF-κB转录活性;RAW264.7细胞分为正常细胞组及PTEN抑制剂组,LPS刺激6h后双荧光素酶报告基因实验检测NF-κB转录活性。5. RAW264.7细胞分为过表达野生型PTEN组及空载体组,每组再分为未刺激及LPS(1μg/ml)刺激后15、30min组,收集细胞蛋白,Western Blot法检测Akt磷酸化水平及总蛋白含量。RAW264.7细胞分为两组,正常细胞组及PTEN抑制剂组,每组再分为未刺激及LPS(1μg /ml)刺激后10、20、30、45、60min组,收集细胞蛋白,Western Blot法检测Akt磷酸化水平及总蛋白含量。6. RAW264.7细胞分为四组,过表达空载体组、过表达野生型PTEN组、过表达C124A-PTEN组、过表达G129E-PTEN组,LPS(1μg /ml)刺激6h后收集细胞培养上清,ELISA法检测TNF-α水平。7. RAW264.7细胞分为LPS(-)组及LPS 1μg /ml刺激20min组。免疫共沉淀法检测PTEN与TLR4交互作用。结果:1. LPS刺激后PTEN蛋白表达在8h未发生明显变化,24h后出现剂量依赖性降低,而48h时却出现剂量依赖性增高。LPS刺激后PTEN磷酸化水平减低,在LPS刺激后20、30、45min降低明显,而PTEN蛋白表达无明显变化。提示LPS刺激后,PTEN可迅速脱磷酸而被活化;2.与干扰RNA对照组相比,siRNA-PTEN引起的PTEN下调导致LPS诱导的TNF-α分泌减少;与正常细胞组相比,PTEN抑制剂组LPS刺激后TNF-α分泌减少。表明PTEN对炎症介质TNF-α具有正向调控作用;3.与空载体转染组LPS刺激后相同时相点相比,过表达野生型PTEN组p-ERK、p-P38、p-JNK水平较弱;与正常细胞组LPS刺激后相同时相点相比,PTEN抑制剂组LPS刺激后p-ERK、p-P38、p-JNK水平增高。提示PTEN对炎症介质TNF-α的正向调控与MAPK关系不大;4.与空载体转染组相比,过表达野生型PTEN组LPS诱导的NF-κB活性增强,而突变型PTEN则没有明显作用;与对照干扰RNA组相比,siRNA-PTEN引起的PTEN下调导致LPS诱导的NF-κB活性减弱;与正常细胞组相比,PTEN抑制剂组LPS诱导的NF-κB活性减弱。表明PTEN可通过正向调控NF-κB的作用参与炎症反应;5.与空载体转染组相比,过表达野生型PTEN组LPS刺激后相同时相点p-Akt水平较弱;与正常细胞组相比,PTEN抑制剂组LPS刺激后相同时相点p-Akt水平增高。提示PTEN对NF-κB活性的正向调控作用是通过下调Akt活性而介导的;6.与空载体转染组相比,过表达野生型PTEN可促进LPS诱导的TNF-α分泌,而蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶双突变型PTEN(C124A-PTEN),以及单纯脂质磷酸酶位点单突变型PTEN(G129E-PTEN)则没有明显作用。表明PTEN促进炎症介质的释放主要与其脂质磷酸酶的活性有关;7.免疫共沉淀实验显示,未予LPS刺激时,PTEN与TLR4结合,LPS刺激20min后,结合减弱。结论:1. LPS可影响PTEN的蛋白表达水平;LPS刺激后PTEN表达在8h不变,24h呈剂量依赖性减少,48h呈剂量依赖性增高。说明LPS在不同时期对PTEN蛋白表达的调控作用不同。LPS刺激可使PTEN脱磷酸,从而活化PTEN,使PTEN参与LPS诱导的TLR4活化的信号通路。2. PTEN可能通过其脂质磷酸酶的作用,抑制下游信号分子Akt的活性,使NF-κB的转录活性增高从而促进了炎性因子的分泌,因而PTEN在LPS信号通路中起促炎作用。3.在本实验条件下,PTEN对LPS诱导的MAPK活化起抑制作用,表明MAPK与PTEN介导的炎症信号通路关系不大,有关PTEN对MAPK抑制作用的分子机制及其意义尚需进一步研究。4. PTEN与TLR4存在交互作用,TLR4很可能是PTEN参与LPS信号通路的上游调控分子。综上所述,我们认为,除经典的MyD88依赖和非依赖的两条信号通路外,LPS对巨噬细胞的炎症活化尚存在另外一条与PTEN相关的信号通路。推测该信号通路的作用机制如下:生理状态下PTEN与TLR4结合形成复合物,受LPS刺激作用后,PTEN脱磷酸而被活化,并与TLR4发生解离,募集至胞膜,作用于细胞膜上的PI(3,4,5)P3,使其脱磷酸,从而发挥对PI3K的抑制作用,使得PI3K下游分子Akt活性减低,下调了Akt对NF-κB活性的负向调控作用,从而促进NF-κB活性增强,进而导致炎症介质TNF-α的释放。详见以下示意图: