百合无症病毒TGB基因克隆、表达及定位分析

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自发现植物病毒的运动蛋白以来,对不同种类运动蛋白的结构、功能的研究已经比较深入,但是对于百合无症病毒(Lily symptomless virus,LSV)运动蛋白的研究还处于初级阶段。本研究通过引物扩增获得LSV的运动蛋白基因;对基因序列进行比对,构建进化树,利用生物信息学软件对基因进行分析;构建原核表达载体,诱导表达TGBp1;利用绿色荧光蛋白融合技术,对运动蛋白进行定位分析。研究结果对了解LSV运动蛋白的结构和功能,以及在病毒侵染过程中的作用机制具有重要的理论参考价值。设计引物,以感病百合“西伯利亚”叶片总RNA为模板,扩增获得LSV的运动蛋白基因,运动蛋白基因全长1161bp,含有三个重叠基因(TGB1、TGB2、TGB3),称为三基因连锁结构(Triple gene blocks, TGB)。生物信息学分析显示,基因编码三段运动蛋白TGBp1(228aa)、TGBp2(106aa)、TGBp3(64aa);进化树分析显示LSV-TGB1与百合潜隐病毒和伽蓝菜属潜隐病毒的TGB1相似度较高,LSV-TGB2与百合潜隐病毒相似度较高,LSV-TGB3与紫茉莉斑点病毒相似度较高,TGB1的保守性最高,TGB3的保守性最差;TGBp3为疏水性蛋白;TGBp1为多功能蛋白,具有RNA解旋酶和核酸水解酶活性,氨基酸序列中含有ATP结合区和核酸结合区,在病毒运动中起主导作用;TGBp2保守性较高,与马铃薯病毒X(PVX)类病毒的TGBp2相似度高,并且TGBp2、 TGBp3都为结构性蛋白,结合到内质网上,在病毒运动中起到辅助作用;TGBp1无跨膜结构域,TGBp2、TGBp3分别有两段、一段跨膜结构域;三段蛋白都没有卷曲螺旋结构;构建三段蛋白的三维结构模型。将TGB1基因连接表达载体PET-28a(+),转入大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞中,诱导TGBp1的表达,SDS-PAGE以及Western-Blot验证带有His标签的TGBp1成功表达,对表达产物进行质谱分析,获得质谱结果。利用亲和层析的原理,根据包涵体纯化的方法,成功纯化得到纯度较好的TGBp1。利用绿色荧光蛋白融合技术,将三段TGB基因连接eGFP,插入到双元表达载体pTF101.1-35S上,转入农杆菌GV3101感受态细胞中,侵染洋葱表皮细胞,用共聚焦显微镜观察三段蛋白在洋葱细胞上定位情况,发现,TGBp1-GFP主要定位在细胞壁或呈点状嵌入细胞壁,少量位于胞质内部;TGBp2与TGBp3主要位于细胞内。
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