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【目的】⑴验证POU5F1(POU domain,class 5,transcription factor 1)、SOX2[SRY(sex determining region Y)-box 2]、KLF4[Kruppel-like factor 4(gut)]和MYC(myelocytomatosis oncogene)基因在绵羊睾丸组织中的表达方式并克隆表达的m RNA序列。构建携带绵羊重编程因子基因序列的逆转录病毒基因传递表达载体,为将来获得绵羊Leydig细胞源诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cell,i PSC)系提供物质基础。⑵用HSD3B染色方法确定成年小鼠Leydig细胞的体外生长形态特征,为更好地鉴别体外培养的绵羊Leydig细胞提供技术基础。【方法】⑴互补DNA模板来源于1周龄和6月龄大的湖羊的睾丸组织,通过RT-PCR和测序分别验证了POU5F1、SOX2、KLF4和MYC基因在绵羊睾丸中的表达方式以及分别对表达的m RNA进行分子克隆。⑵基因组模板来自培养的30-40妊娠日龄的蒙古绵羊的胎儿成纤维细胞,通过PCR和测序验证绵羊KLF4的基因组序列。⑷构建4个携带绵羊重编程因子基因序列的逆转录病毒基因传递表达载体,分别为p MXs-o POU5F1、p MXs-o SOX2、p MXs-o KLF4和p MXs-o MYC质粒。用限制性内切酶酶切法和测序法验证构建质粒序列的正确性。⑸将参照组的p MXs-GFP质粒和构建的4个质粒运用磷酸钙转染法分别转染入Phoenix Amphotropic细胞系。转染48 h和72 h后,在荧光条件下观察p MXs-GFP的转染效果,并对培养的新生绵羊的Leydig细胞进行感染。细胞感染4 d后,在荧光条件下观察p MXs-GFP质粒对绵羊Leydig细胞的感染效果,并用RT-PCR法验证这4个质粒携带基因的外源表达情况。⑹2月龄大的小鼠睾丸,剥离白膜后,用胶原酶消化获得Leydig细胞。Leydig细胞通过HSD3B染色方法鉴定。【结果】⑴POU5F1在新生的和性成熟的湖羊睾丸中均表达。绵羊POU5F1的m RNA包含了一个1080 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码了359个氨基酸。绵羊POU5F1含有1个POU结构域和1个homeobox结构域。绵羊POU5F1蛋白第206位的赖氨酸和第207位的缬氨酸的序列是物种特异的,其它的哺乳动物在此对应的赖氨酸和缬氨酸位点之间还有一个色氨酸。⑵SOX2在新生的和性成熟的湖羊睾丸中均表达。绵羊SOX2的m RNA含有一个963 bp的ORF,编码了320个氨基酸。绵羊SOX2含有1个HMG(high mobility group)结构域。⑶MYC在新生的绵羊睾丸中表达。绵羊MYC的m RNA包含了一个1320 bp的ORF,编码了439个氨基酸。绵羊MYC含有1个HLH(helix-loop-helix)结构域。⑷绵羊KLF4基因组从起始密码子到终止密码子的序列长度为3159bp,含有一个1434 bp的ORF,编码了477个氨基酸的蛋白质。绵羊KLF4基因含有4个外显子和3个内含子。绵羊KLF4蛋白在肽链的碳端有3个C2H2(cysteine2/histidine2)型的锌指。POU5F1、SOX2、KLF4和MYC氨基酸序列分析表明绵羊与牛有着最近的进化关系,与灵长类和啮齿类有着相对较远的进化关系。SOX2和KLF4蛋白的氨基酸序列在绵羊和牛中是100%的一致。⑸限制性内切酶酶切法和测序法验证了构建的p MXs-o POU5F1、p MXs-o SOX2、p MXs-o KLF4和p MXs-o MYC质粒序列的正确性。通过用p MXs-GFP质粒做对照,预测这4个构建的质粒能够在AMPHO细胞系中有效地转染。RT-PCR结果表明,这4个逆转录病毒质粒携带的外源基因均能够在绵羊Leydig细胞基因组中整合并转录。⑹HSD3B染色鉴定后表明,培养48 h的成年小鼠Leydig细胞,在光学显微镜下能够清晰地分辨出Leydig细胞的细胞核与细胞质。Leydig细胞的细胞核大而圆;细胞质布满了致密的脂滴,细胞质折光性强。Leydig细胞培养5 d后,细胞充分伸展,形态多样。一些细胞聚集生长,一些细胞单独生长。聚集生长的各个细胞通过细胞的触角(cellular tentacles)相互联系,形成了表皮样的外貌。RT-PCR结果显示,体外培养5 d的Leydig细胞能够表达Leydig细胞特异的转录,包括HSD3B6、CYP17A1和St AR。【结论】新生湖羊的睾丸组织能够表达POU5F1、SOX2和MYC基因,但不表达KLF4基因。获得了绵羊POU5F1、SOX2和MYC基因的编码区的m RNA序列,以及获得了蒙古绵羊KLF4的基因组序列。构建了有效的携带绵羊重编程因子基因序列的逆转录病毒基因传递表达载体,分别为p MXs-o POU5F1、p MXs-o SOX2、p MXs-o KLF4和p MXs-o MYC。鉴定了体外培养的成年小鼠Leydig细胞的生长形态特征,为将来更好地鉴定体外培养的绵羊Leydig细胞提供技术基础。这些研究结果可为将来获得绵羊Leydig细胞源i PSCs打下基础。