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HBV感染是世界范围的公共卫生问题，我国尤为严重。目前，无论是长效干扰素的应用，抑或新型核苷类似物均不能有效清除体内持久存在的HBV cccDNA。彻底清除cccDNA需要新的策略，而理解和阐明HBV cccDNA形成机制是寻找根除HBV感染方法的必要前提。对比HBV rcDNA与HBV cccDNA基因组结构可知，在HBV cccDNA分子形成中，必不可少的一个环节是船V rcDNA负链5’端或3’端冗余序列被去除，进而形成闭合的环状DNA分子，我们将集中研究此环节，试图解析出冗余序列的去除机制。 目的： 解析在HBV rcDNA形成HBV cccDNA过程中，负链冗余序列5’r和3’r被去除的部位，探索HBV cccDNA形成的分子机制。 方法： 1、构建C1826A定点突变的HBV DNA表达质粒，并构建含C1826A突变的HBV稳定复制细胞系。 2、建立HBV rcDNA正链及HBV cccDNA特异性扩增方法。 3、建立基于PCR技术的定点突变位点检测方法，通过方法学比较做出方法学评价。 4、TA克隆含nt1826位点的HBV rcDNA正链扩增片段，菌液PCR检测样本，计算突变型和野生型比率。 5、TA克隆含nt1826位点的HBV cccDNA片段，菌液PCR检测样本，计算突变型和野生型比率。 6、综合分析，解析在HBV cccDNA形成过程中，HBV rcDNA负链冗余序列去除部位及机制。 结果： 1、ELISA检测细胞培养上清HBsAg、Real-time PCR及SouthernBlot检测细胞内提取病毒DNA，结果均显示稳定细胞系能够正常复制HBV DNA；且细胞基因组DNA片段测序分析表明含有C1826A突变。 2、5’端含外源序列的单引物PCR延伸，产物纯化，再以外源序列和上游引物组合PCR能够特异扩增含nt1826位的HBV rcDNA正链片段。 3、跨负链5’及3’末端间隙之上下游引物可特异扩增HBVcccDNA。 4、TA克隆含nt1826位碱基的HBV rcDNA正链片段，菌液PCR检测样本，其中nt1826位野生型(C)比率为83％-99％，突变型(A)比率为1％-17％。 5、TA克隆含nt1826位碱基的HBV cccDNA片段，菌液PCR检测样本，其中nt1826位野生型(C)比率为43％-69％，突变型(A)比率为31％-57％。 结论： 1、稳定转染含C1826A突变的HBV DNA细胞系支持HBV复制，可作为后续研究工具。 2、成功建立了HBV rcDNA正链及HBV cccDNA特异性扩增方法。 3、建立了基于PCR技术的突变位点检测方法，其可有效区分并反映定点突变碱基情况。 4、在pgRNA逆转录HBV rcDNA过程中，至少多数正链的合成以5’r为模板，且一直延伸至其末端。 5、在HBV cccDNA形成过程中，至少多数HBV rcDNA负链冗余序列去除部位为5’r。