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第一部分羧基荧光素乙酰乙酸对大鼠骨髓间质干细胞体外染色的研究目的:探讨活体染料羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)标记大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)的可行性和最适条件。方法:清洁型SD大鼠20只,用密度梯度离心及贴壁法相结合的方法分离、纯化、培养大鼠MSCs,取长满25cm2培养瓶瓶底的第三代大鼠MSCs用2.5、5、10、20、40μmol/L不同浓度的CFSE分别作用1、5、10、15、20min进行染色,通过观察染色后细胞荧光强度和细胞贴壁率筛选出CFSE标记大鼠MSCs的最适标记时间和标记浓度。采用MTT法检测最适条件下CFSE标记的大鼠MSCs的增殖能力。结果:浓度10μmol/L的CFSE在37℃下孵育10min为MSCs染色、观察和研究的最适条件,在此条件下,CFSE标记的MSCs的增殖能力不受影响。结论:活体染料CFSE是一种标记率高、细胞毒性小、操作简便的标记大鼠MSCs的新方法,浓度10μmol/L的CFSE在37℃下孵育10 min为CFSE标记大鼠MSCs的最适条件。第二部分大鼠脊髓损伤后炎症级联反应及其对静脉移植骨髓基质干细胞在损伤脊髓内存活和迁移的影响目的:观察大鼠急性脊髓损伤(SCI)后炎症级联反应及其对静脉移植骨髓基质干细胞(MSCs)在损伤脊髓内存活和迁移的影响,探讨MSCs静脉移植治疗急性SCI的最佳移植时间。方法:Allen法制造SCI动物模型。80只SD大鼠随机分为假手术组、SCI后1 h、6 h、12 h、24 h、3 d、5 d和7 d组,不同时间点取脊髓组织,应用HE染色法观察脊髓组织结构,应用RT-PCR法观察肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和中性粒细胞趋化因子-1(CINC-1)表达情况,应用免疫组织化学法观察细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达情况,应用化学法测定髓过氧化物酶(MPO)活性变化;另40只SD大鼠随机分为假手术组、SCI后1 h、6 h、12 h、24 h、3 d、5 d和7 d移植组,移植后7 d取脊髓组织,荧光显微镜下观察不同移植时间点脊髓损伤处MSCs的存活和迁移情况。结果:TNF-α和IL-1β在大鼠SCI后1 h开始表达,SCI后6 h到达峰值;ICAM-1和CINC-1在大鼠SCI后6 h表达增高,SCI后12 h到达峰值;MPO活性在大鼠SCI后6 h开始表达,24 h表达到达峰值。SCI后6 h,中性粒细胞(PMNL)开始浸润,SCI后24 h,PMNL大量浸润。SCI后3 d, PMNL浸润减少,MPO活性表达开始减弱;SCI后5 d和7 d,脊髓损伤区有胶质细胞增生。SCI后0h、6 h、12 h、24 h移植四组,脊髓损伤处的BMSCs的存活数量较少,但迁移距离较长;SCI后3 d移植组,脊髓损伤处的BMSCs的存活数量较多,且迁移距离较长;SCI后5 d和7 d移植两组,脊髓损伤处的BMSCs的存活数量较少,且迁移距离较短。结论:急性SCI后,在损伤脊髓内存在炎症级联反应。在SCI后1 h、6 h、12 h、24 h,由于损伤区的炎症级联反应,局部的微环境不适合移植的MSCs存活;在SCI后5 d、7 d,由于损伤区胶质细胞增生,不利于移植MSCs的迁移。在SCI后3 d可能是静脉移植MSCs治疗大鼠SCI的最佳移植时间。第三部分静脉移植骨髓间质干细胞在损伤脊髓内的定向分化目的:探讨移植MSCs在损伤脊髓内是否能分化为功能性的神经元和神经胶质细胞。方法:应用免疫电镜技术观察迁移在损伤脊髓内1、3、5周后的移植MSCs的超微结构,应用免疫荧光标记和激光共聚焦技术观察迁移在损伤脊髓内1、3、5周后的移植MSCs表达胆碱乙酰基转移酶(ChAT)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、突触素(synapsins)、髓磷脂碱性蛋白(MBP)和髓鞘蛋白前脂蛋白(PLP)的情况。结果:移植1周后,迁移在损伤脊髓灰质内的MSCs细胞器不发达,不具有神经元的超微结构特点,而迁移在损伤脊髓白质内的MSCs细胞器发达,具有少突胶质细胞的超微结构特点。移植3周后,迁移在损伤脊髓灰质内后的MSCs细胞器开始发达,具有神经元的超微结构特点。移植1周后,迁移在损伤脊髓灰质内后的MSCs不表达ChAT、GAD和synapsins,而迁移在损伤脊髓白质内的MSCs开始表达MBP和PLP。移植3周后,迁移在损伤脊髓灰质内的MSCs开始表达ChAT、GAD和synapsins。迁移在损伤脊髓白质内的MSCs数量明显多于灰质内的MSCs。结论:移植MSCs在损伤脊髓内可部分分化为功能性的神经元和神经胶质细胞,而且MSCs在损伤脊髓内分化为功能性神经胶质细胞的时间较早,数量较多。第四部分静脉移植骨髓间质干细胞对大鼠脊髓损伤后少突胶质细胞再髓鞘化的影响目的:观察骨髓间质干细胞移植治疗对脊髓损伤后少突胶质细胞增生及新生轴突髓鞘再形成的影响。方法:60只SD大鼠随机分为假手术组、对照组和实验组,假手术组和实验组经尾静脉注射MSCs,对照组经尾静脉注射PBS。注射MSCs后1、3W,电镜观察各组髓鞘和少突胶质细胞的超微结构变化;免疫组织化学荧光标记技术检测脊髓组织髓磷脂碱性蛋白(MBP)和髓鞘蛋白前脂蛋白(PLP)的表达。免疫荧光标记和激光共聚焦技术观察迁移在损伤脊髓内1、3周后的移植MSCs表达髓磷脂碱性蛋白(MBP)和髓鞘蛋白前脂蛋白(PLP)的情况。结果:脊髓损伤后1W,对照组髓鞘明显肿胀,部分崩解;部分少突胶质细胞坏死溶解,可见较多增生的少突胶质细胞。脊髓损伤后3W,髓鞘肿胀较轻,可见增生的少突胶质细胞。脊髓损伤后1W,实验组髓鞘肿胀明显减轻,少突胶质细胞坏死少,可见大量增生的少突胶质细胞,脊髓损伤后3W,实验组髓鞘和少突胶质细胞结构正常,可见许多增生的少突胶质细胞。免疫组织化学荧光标记结果显示,对照组MBP和PLP表达低于假手术组,实验组MBP和PLP表达高于对照组。移植1周后,迁移在损伤脊髓白质内的MSCs表达MBP和PLP。结论:脊髓损伤后骨髓间质干细胞移植治疗可有效防止少突胶质细胞坏死和神经纤维溃变,促进少突胶质细胞增生和再生神经纤维髓鞘的再形成。