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灭多威是一种高毒的肟类氨基甲酸酯类农药,除了常见剂型外,还可以作为复配剂,应用广泛。它通过抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)而防治多种害虫。灭多威于1997年被世界野生动物基金会列为可疑内分泌干扰物,可损坏机体的抗氧化系统,此外,还有可能具有遗传毒性。目前灭多威的降解方法主要有物理法和化学法,生物降解法较少。生物降解法具有高效、易操作、环保经济等优点,是消除环境中农药污染的主要手段。因此,筛选灭多威降解菌株和克隆相关降解基因对灭多威污染环境的修复具有重要意义。本研究主要取得以下结果:1.从农药厂废水处理系统的活性污泥中分离到两株联合降解灭多威的菌株,分别命名为MDW-2和MDW-3,并分别初步鉴定为Aminobacter sp.和Afipia sp.。它们可以在3天内完全降解50 mg/L灭多威。菌株MDW-2首先对灭多威进行降解,并积累一种中间代谢产物,该产物不能被菌株MDW-2继续降解,但可以被菌株MDW-3完全降解。2.由于菌株MDW-2在灭多威降解过程的作用是水解其氨基甲酸酯键,从而对其进行脱毒,这是灭多威降解的关键步骤。因此本研究主要对菌株MDW-2的生长和降解特性进行研究。其最适生长温度为30℃;最适生长pH值为7.0。菌株MDW-2以1%的接种量可以在18 h内降解200 mg/L灭多威,其最适降解温度范围为30～35℃;最适降解pH值为7.0。3.结合HPLC-MS进行的产物鉴定和菌株利用灭多威的生长情况,推测灭多威的代谢途径为:菌株MDW-2首先将灭多威水解为灭多威肟和甲基氨基甲酸,并利用后者生长;然后菌株MDW-3继续完全降解灭多威肟,并利用灭多威肟生长。4.综合利用硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose fast flow阴离子交换层析、Q-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex-200凝胶层析这些蛋白纯化方法,从菌株MDW-2粗酶液中纯化出可以用于肽指纹图谱分析的降解灭多威的水解酶。将肽指纹图谱得到的肽段序列和菌株MDW-2基因组中氨基酸序列比对分析,找到一个orf06623,将对应的编码基因命名为灭多威的水解酶基因ameH,它的全长为951 bp,编码316个氨基酸。对蛋白氨基酸序列进行比对分析,发现AmeH仅与Schizosaccharomyces pombe ATCC 24843 推测的甲酰胺酶 C869.04(27%)、Mycobacterium smegmatis NCTC 8159 的乙酰胺酶(28%)、Methylophilus methylotrophus的甲酰胺酶(26%)的相似性最高。表明该基因可能是一个新基因。5.将ameH基因和表达载体pET24b连接后转入大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)中进行蛋白异源表达,用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化,蛋白大小约33 kDa,条带单一。经20 mMTris-HCl(pH7.4)缓冲液透析后的AmeH具有转化灭多威为灭多威肟的活性,表明ameH就是编码灭多威水解酶的基因。