研究背景：　　肺癌（LungCancer，LC）是目前影响人类健康的主要恶性肿瘤之一，其发生率和死亡率均为癌症之首。据国际癌症组织数据显示：在2008年确诊肿瘤中，12.7％为肺癌，总例数为1610000；因为肺癌而死亡人数占全球肿瘤死亡人数18.2%，共1380000例。近年来研究表明：大部分西方国家包括北美，澳大利亚，其男性肺癌死亡率有所下降，但在我国和其他亚、非洲国家，肺癌发生率依然呈上升趋势。且随着国家工业化发展，环境污染日益严重，我国肺癌发生率跟死亡率急剧上升，已成为居民生命健康的主要威胁。　　大量流行病学研究发现吸烟是导致肺癌发生发展的主要环境影响因素，80%肺癌发生与吸烟有关，但只有10-15%吸烟者最终会发生肺癌，同时部分非吸烟者也有发生肺癌而死亡的，这提示除环境因素外，遗传因素在其发生发展中也起重要作用。目前由于缺乏有效的早期诊断技术和方法，大部分肺癌患者未能在早期得以发现和治疗，故肺癌预后差，5年生存率仅约15%。因此，探索该病病因，包括环境和遗传因素，从而在一级预防基础上降低肺癌发生显得尤为重要。　　吸烟，辐射等因素均可引起基因组DNA双链断裂（DSBs），而这是DNA损伤最严重的方式之一。如果DSBs修复不完全或者障碍将导致染色体结构异常，基因组不完整而引起细胞凋亡甚至肿瘤的发生。DSBs修复包括两个途径：同源重组修复(homologousrecombinationrepair,HR)和非同源末端连接(non-homologousendjoining,NHEJ)。NBS1（P95或NBN）蛋白，作为Mre11-Rad50-NBS1(MRN)蛋白复合物组成成分之一，在DSBs两条修复途径中均发挥关键作用：NBS1通过募集Mre11和Rad50到DSB处形成MRN复合物之后利用其特殊的构象形成一个连接DNA与染色质的支架,从而在同源重组修复途径中作为重要DNA修复蛋白稳定DSB中的DNA末端；同时通过ATM/NBS1/SMC1和ATM/FANCD2途径参与细胞周期检查点调控。目前研究认为：NBS1可招募PIKK蛋白家族成员共济失调-毛细血管扩张突变蛋白(ataxia-telangiectasiamutatedprotein,ATM)，ATM和Rad3相关蛋白(ATMandRad3-relatedprotein,ATR)和DNA依赖蛋白激酶催化亚单位（DNA-PKcs）而激活ATM依赖DNA损伤信号通路，或通过NBS1蛋白N端BRCT/FHA结构域与磷酸化组蛋白H2AX的相互作用而招募Mre11和Rad50到DSBs处形成Mre11-Rad50-NBS1(MRN)蛋白复合物，最终发挥DNA损伤修复功能。NBS1过表达在吸烟相关肿瘤：肺癌，肝癌，头颈部和食道肿瘤均有相关报道；而且，少见的NBS1基因突变会引起一种常染色体隐性遗传病——Nijmegen断裂综合征(Nijmegenbreakagesyndrome,NBS)。该病发生与DNA修复能力低下而导致染色体不稳定密切相关，以头小畸形、免疫功能缺陷、对电离辐射高度敏感，患癌症几率高为特征，40%病人在21岁前即发生肿瘤，因此推测，NBS1基因遗传变异也极有可能增加肿瘤的发病风险。　　人类NBS1基因位于染色体8q21，基因组全长约50kb,共包含16个外显子，编码754个氨基酸。分子质量约为95ku的NBS1蛋白可分为三个结构域：N端，包括介导磷酸化蛋白间特异性结合的两个叉头相连(forkhead-associated,FHA)区域和与FHA共同介导蛋白间相互作用的肿瘤抑制基因BRCA1C端(BRCT)区域；中间区域，包含可被ATM和ATR这两种磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)磷酸化的SQ氨基酸序列；C端，NBS1蛋白通过该区域与Mre11,Rad50和ATM蛋白结合。　　近年来很多研究结果显示：NBS1单核苷酸多态性与人类几种肿瘤如肺癌，乳腺癌，鼻咽癌等发病相关；且最近全基因组关联研究（GWAS）显示：位于NBS1基因附近8q21.1处几个单核甘酸多态性（SNPs）与肺癌发病风险显著相关，但是在这些SNPs中，NBS1基因SNP8360G/C(Glu185Gln,E185Q,rs1805794)与肺癌发病被广泛研究，其结果并不一致且该位点功能和肿瘤易感性方面是否相关并不清楚。因此，为了进一步探讨NBS1基因外显子E185Q遗传变异与肺癌发病风险的关系，本研究拟进行：（1）通过广州，苏州两中心独立样本病例对照研究，探讨NBS1基因SNPrs1805794G＞C与肺癌发病关联，并用功能实验验证该遗传变异的生物学功能；（2）根据现有对NBS1基因SNPrs1805794G＞C与肿瘤发病相关文献进行meta分析，并按肿瘤类型和不同种族分层，对该多态位点与肺癌关联做客观评价。从而为肺癌预防和控制提供科学依据。　　第一部分：NBS1基因E185Q(rs1805794G＞C)遗传变异与人群肺癌发病的病例-对照研究　　目的：　　探究NBS1基因SNPrs1805794G＞C与我国人群肺癌发病关联并分析基因与环境因素的交互作用，进一步通过生物学功能实验阐述该位点遗传变异与肺癌发病的生物学机制，为肺癌早期诊断，早期治疗提供科学依据。　　方法：　　在广州和苏州两地开展以医院为基础的双中心病例-对照研究。广州地区人群作为发现关联的人群是从2007年3月到2009年3月在广州市五家医院连续收集的新诊断的并经病理学证实的肺癌病例1056例，对照1056例随机选自同期在广州市区参与社区健康体检的10000健康体检者，病例对照按性别相同、年龄（±1岁）频数匹配。苏州地区人群作为验证关联的人群是从2008年3月到2010年5月在苏州大学第一附属医院连续收集的新诊断肺癌病例503例，对照623例随机选自同期居民健康体检3500体检者，病例对照按性别相同、年龄（±5岁）频数匹配。调查问卷收集由经过培训合格的调查员在经参与者知情同意的情况下统一收集相关信息，包括人口学基本特征和环境变量，如年龄，性别，职业，吸烟，饮酒等。采用PCR-RFLP的方法检测前述两人群NBS1基因SNPrs1805794G＞C的基因型；用SAS9.3统计软件拟合优度χ2检验来分析年龄、性别、吸烟、饮酒、家族肿瘤史等项目信息和该多态位点基因型在病例组和对照组间频率分布的差异；同时用哈迪-温伯格平衡（Hardy-WeinbergEquilibrium，HWE）检验，判断对照人群的群体代表性；采用非条件多因素Logistic回归分析NBS1基因SNPrs1805794G＞C与人群肺癌发病关联及“基因-环境”的交互作用，所有检验均为双侧检验，检验水准α=0.05，P<0.05为差异具有统计学意义。　　针对该关联位点NBS1基因第五外显子变异（Glu185Gln），用X-射线对人外周血淋巴细胞照射后，分析其染色体断裂数与该位点不同基因型之间的关联，同时构建含不同等位基因的pcDNA3.1表达载体，转染人肺细胞系16HBE，采用real-timePCR和westernblot方法检测转染效果，运用X-射线诱导，彗星试验（CometAssay）检测转染成功的含该位点不同等位基因的16HBE细胞DNA损伤程度。Student‘st检验用于检测不同等位基因与X射线诱导细胞染色体断裂数和DNA损伤程度差异。结果：　　1.1广州，苏州两地人口学特征及单因素分析　　广州地区1056例肺癌，按病理类型分类，包括腺癌384例（36.4%），鳞癌369例（34.9%），大细胞肺癌43例（4.1%），小细胞肺癌128例（12.1%），其他类型132例（12.5%）；按病理分期I~IV期的例数分别为154例（14.5%）、94例（9.0%）、333例（31.5%）及475例（45.0%）。苏州地区503例肺癌，包括腺癌231例（45.9%），鳞癌158例（31.4%）,大细胞癌23例（4.6%），小细胞癌65例（12.9%），其他类型肺癌26例（5.2%）；按病例分期I~IV期例数分别为46例（9.2%），53例（10.5%），157例（31.2%），247例（49.1%）。单因素分析结果显示：年龄、性别、肺癌家族史在广州、苏州两地病例与对照组的分布差异无统计学意义（广州人群：P值分别为0.931、1.000和0.150；苏州人群：P值分别为0.793、0.496和0.907）；但吸烟、年吸烟量、饮酒、医学射线暴露在两中心人群病例和对照组中差异有统计学意义（广州人群：P值分别为0.028、9.40×10-12、0.042和0.014；苏州人群：P值分别为1.79×10-7、0.011、0.017和0.041），说明以上因素为我国肺癌发病的危险因素。1.2NBS1基因SNPrs1805794G＞C遗传变异与肺癌发病的关联分析　　所研究的单核苷酸多态位点基因型频率在对照人群中符合哈迪-温伯格平衡(广州人群:?2=0.002,P=0.960;苏州人群:?2=0.001,P=0.971)。在广州地区人群结果显示：rs1805794G>C多态与肺癌发病风险相关，携带变异基因型（CG+CC）个体的肺癌发生风险是携带GG野生基因型个体的1.46倍(OR=1.46;95%CI=1.22-1.75)；相近的结果在苏州地区人群中得到验证，以携带GG野生基因型个体为参照，携带变异基因型（CG+CC）个体的肺癌发生风险显著增加30%(OR=1.30;95%CI=1.01-1.68)；经同质性检验（Breslow-Day检验）结果显示两中心人群该多态位点基因型分布一致（P=0.380），故合并两人群分析以增加检验效能。合并分析发现，携带变异基因型（CG+CC）个体的肺癌发生风险是携带GG野生基因型个体的1.40倍(OR=1.40;95%CI=1.21-1.62)；以上结果提示：NBS1基因SNPrs1805794G＞C遗传变异与肺癌发病相关，以携带GG野生基因型个体为参照，携带变异基因型（CG+CC）个体的肺癌发生风险显著增加。　　1.3分层分析　　进一步分层分析结果显示：rs1805794G＞C变异与医学辐射暴露存在显著的交互效应（P=0.015）；与携带rs1805794GG基因型比较，携带C变异基因型(CG+CC)的个体发生肺癌的危险性在男性、不饮酒、中量水平医源辐射暴露的人群中更为显著（分别对应OR=1.50,95%CI=1.26-1.79；OR=1.45，95%CI=1.23-1.71；OR=1.53，95%CI=1.23-1.91）；但在吸烟，饮酒等环境因素中并未发现与该位点多态存在交互作用。　　1.4NBS1基因SNPrs1805794G＞C遗传变异与X射线诱导淋巴细胞染色体断裂数的关联分析　　X射线诱导淋巴细胞染色体断裂实验结果显示：在携带rs1805794C变异基因型（CG+CC）的个体外周淋巴细胞经X射线处理后，染色体断裂数量比携带GG基因型个体显著增加，差异有统计学意义（分别为：mean±SD=0.168±0.083vs0.130±0.086,Student‘st-test:P=0.036)。　　1.5NBS1基因SNPrs1805794G＞C遗传变异与X射线诱导16HBEDNA损伤程度的差异分析　　彗星试验结果表明：rs1805794CC变异基因型细胞经X射线处理后，DNA损伤程度指标Olive尾矩(OTM)显著高于rs1805794GG基因型细胞，差异有统计学意义（OTM依次为：mean±SD,5.17±0.71vs.3.14±0.41,student‘st-test:P=0.015）。　　结论：　　NBS1基因SNPrs1805794C遗传变异可增加我国人群肺癌发病风险，且与医学辐射暴露存在基因-环境交互效应，可能与该多态位点CC基因型可增加机体细胞染色体断裂，降低机体DNA损伤修复能力，从而增加人群肺癌发生风险。　　第二部分：NBS1基因E185Q(rs1805794G＞C)遗传变异与肿瘤发病风险的meta分析　　目的：　　NBS1基因SNPrs1805794G＞C遗传变异与肿瘤发生风险被广泛研究且有相关报道，但其结果并不一致。故本研究为全面客观评价两者之间的关系，我们运用meta分析方法对国内外相关研究作系统综述，进一步明确该多态位点与肿瘤，特别是与肺癌的关系，为研究肺癌发病原因提供科学依据。方法：　　计算机检索PubMed、中国期刊全文数据库（CNKI）等，文献检索时间从2000年1月到2012年5月。使用的检索关键词包括NBS1polymorphism和cancer。文献选用和排除标准：病例对照研究；文章对肿瘤诊断和病例，对照纳入有详细介绍；基因型频率是可知的；作者必须报道研究对象数量，比值比（OR）和95%可信区间（95%CI）；数据收集和分析方法必须是统计学上认可的；排除摘要，案例报告，社论和综述。　　采用ORs值和95%CI作为效应估计值。使用Q检验判断各研究间异质性，异质性检验结果p<0.10，因此本研究选用随机效应模型（DerSimonian-Laird方法）。结合分层分析检验结果的稳定性；以漏斗图判断是否存在发表偏倚。应用STATA11.0统计软件进行Meta分析。此外，我们还对肿瘤类型（肺癌，乳腺癌等）和种族（中国人，白种人等）进行分层分析，对比各亚层的合并OR值。　　结果：　　纳入的21篇（包括本研究）病例对照研究文献，病例为9554例，对照12090例。NBS1基因SNPrs1805794C变异能显著增加肿瘤发生风险（OR=1.30，95%CI=1.14-1.49）。根据肿瘤类型分层后，我们发现rs1805794C变异（CG+CC）与肺癌发生呈正相关（OR=1.35,95%CI=1.20–1.51）,但在其它亚层（乳腺癌，基底细胞癌）中均未发现其与该多态位点变异关联有统计学意义。在以种族分层后，不论是中国人，白种人还是印度人，rs1805794C变异（CG+CC）与肿瘤发生均为正相关（中国人：OR=1.60,95%CI=1.28–1.99；白种人：OR=1.09,95%CI=1.02–1.17；印度人：OR=5.60,95%CI=2.83–11.10），但在美国黑人中并未发现其与该多态位点变异关联有统计学意义。　　结论：　　本研究通过meta分析，进一步验证NBS1基因SNPrs1805794C变异能显著增加肿瘤发生风险，且能显著增加中国人群肺癌发生风险。