软骨是存在于人和动物体内的重要组织之一,体内大多数软骨组织都承受着较大的机械载荷,因此,软骨组织容易受伤。与大多数组织不同,软骨没有血管、神经和淋巴管,软骨组织其主要功能是提供一个光滑、润滑的表面,以便于使表面摩擦系数较低以传递机械载荷。目前有几种修复方法,但其修复效果非常有限。近年来组织工程技术的快速发展为软骨修复提供了新的解决方案。基于三维支架的生物打印通过在小单位尺寸上生物材料和细胞的“逐层”沉积,创建有组织的生物构建体使组织再生。与传统的组织工程材料制备方法相比,该技术通过精细控制细胞分布以及机械和化学性质的调节,显示出模拟天然软骨的重要优势。基于挤出的3D生物打印已经被用于制造骨软骨再生的多相支架,大多数现有的商业生物打印机都是基于该技术。生物墨水的特性对于通过3D生物打印开发功能性活组织来说至关重要。基于支架和细胞组合的生物墨水应能同时满足生物材料性能和生物学特征。此外,为了模拟软骨的生理结构,还需要符合下列具体特征:如可打印性、生物可吸收性和生物降解性以保证关键生物材料的良好性能。基于此,本研究采用壳聚糖、明胶、透明质酸等通过调节各种材料的不同配比进行流变检测,选择出最适宜打印的生物墨水组合与比例。最终筛选出的适宜打印的生物墨水的比例为壳聚糖(Chitosan,Cs):明胶(Gelatin,Gel):透明质酸(Hyaluronic acid,HA)=1:8:0.02。为了提高复合支架材料的机械性能,观察掺杂微量石墨烯对支架物理性能以及生物相容性的影响,在Cs:Gel:HA=1:8:0.02复合比例的基础上分别掺杂了0.024%、0.06%、0.1%的石墨烯,将不掺杂石墨烯的生物墨水作为对照组。通过结合生物墨水的流体特性综合调节3D生物打印机的温度、打印速度、气泵压力及填充间距等参数,以确定最适宜打印该生物复合支架的打印条件。本研究选用可以优势互补的Cs、Gel、HA为基础原料,在此基础上添加微量石墨烯,使用3D生物打印技术打印成型之后进行冷冻干燥制备出大小为8mm×8mm×2mm以及8mm×8mm×5mm两种规格的复合支架。得出的结论主要有:制备的各组不同比例的支架既具有300μm左右的大孔同时又有50~70μm左右的小孔,复合支架的这种多孔结构有利于后续细胞在支架上的生长、伸展及增殖等细胞行为。加入石墨烯后,复合支架的孔隙率并无显著性变化,各组复合支架孔隙率较高且均可达到80%以上。只是孔壁变厚变光滑,孔径有些微减小。通过能谱仪(Energy Dispersive Spectrometer,EDS)元素分析以及偏光显微镜观察,可知石墨烯按照所添加的比例成功掺杂进了各组复合支架中并且可在支架内部均匀分布。在吸水率方面,加入石墨烯的复合支架材料的亲水性能低于对照组支架,但各组支架都具有很强的吸水性,可用于后续的细胞研究。检测各组支架在2周内的降解率,由检测结果可知对照组的复合支架降解率最高,添加石墨烯的复合支架降解率较对照组而言有所降低。但复合支架降解率并不随石墨烯的添加量呈线性变化,因此石墨烯的含量并不是决定复合支架降解率的主要因素。本研究中所使用的骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)生长状态良好并且增殖能力也较强,具有向软骨分化的能力。将BMSCs接种到复合支架上进行培养,构建细胞-支架复合物并分别考察BMSCs培养11天内的生长情况。首先观察一周内细胞在各组支架上的增殖情况,使用Calcein-AM染色、Propidium Iodide染色和Hochest 33342染色分别观察第1、3、5、7天的细胞存活情况。发现随着培养时间的增长,细胞在支架上均良好增殖,支架上活细胞数量多,死细胞数量较少,在支架培养第3天时使用单光子荧光显微镜观察发现细胞在支架上保持着良好的生物活性,且在支架上分布均匀,支架表面均有活细胞粘附与伸展,在细胞接种到支架11天时对细胞-支架复合物进行固定,使用扫描电镜进行观察,发现复合支架的内部孔道及支架外表面均有大量细胞黏附、伸展、增殖,各种检测均说明各组复合支架的生物相容性良好,但含有石墨烯的复合支架材料上BMSCs的状态要优于对照组支架。