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木质纤维素是世界上最丰富的可再生资源,高效处理和资源化利用木质纤维素对于人类社会的可持续发展有着非凡的意义。在自然界中,以解纤维梭菌（Ruminiclostridium cellulolyticum）和溶纸梭菌（Ruminiclostridium papyrosolvens）为代表的产纤维小体梭菌,具有高效的木质纤维素降解能力,是潜在的利用整合生物加工技术（CBP）生产液体燃料的候选菌株。然而,这些菌株尤其是R.papyrosolvens的遗传改造手段相对缺乏,而且已有的技术仍存在一些缺陷,例如R.cellulolyticum质粒的转化需要体外甲基化和Clos Tron技术存在脱靶现象,这些缺陷严重阻碍了产纤维小体梭菌的基因工程改造,以及木质纤维素的生物转化技术的开发。本论文以R.cellulolyticum和R.papyrosolvens为研究对象,开发了一种质粒体内甲基化系统并实现了R.cellulolyticum中质粒的高效快速转化;另一方面,鉴定并筛选出能够在R.papyrosolvens中高效工作的诱导型启动子,这些工具的开发为纤维素降解梭菌的遗传改造奠定了基础。具体研究内容如下:I.构建R.cellulolyticum转化的体内甲基化系统原核生物中普遍存在一种生物免疫系统——限制修饰系统（Restriction-Modification system,RM system）,能够区分自我/非自我的DNA成分,可以保护宿主免受外源DNA的侵害的。R.cellulolyticum中存在II型限制性内切酶Cce I,导致外源质粒无法直接转入。因此,现有的转化方法首先需要M.Cce I甲基转移酶在体外对质粒进行甲基化。但是M.Cce I甲基转移酶昂贵、容易失活且延长了转化时间。为了克服现有体外质粒甲基化方法的不足,我们克隆了源于R.cellulolyticum的M.Cce I甲基转移酶基因（Ccel2867）,并筛选出了能功能性表达M.Cce I甲基转移酶的大肠杆菌工程菌株。通过该工程菌株,我们实现了质粒的体内甲基化,并成功将该甲基化的外源质粒转化至R.cellulolyticum中。利用上述方法,将基于Clos Tron系统构建的限制性内切酶基因cce I敲除质粒成功转化到R.cellulolyticum中,并实现对cce I基因的插入突变。本研究中的一个难点在于如何使甲基转移酶基因在大肠杆菌中功能性表达。大肠杆菌存在Ⅳ型修饰依赖的限制性修饰系统如Mcr A,Mcr BC等,这些Ⅳ型系统能特异识别并剪切甲基修饰的DNA。因此,DNA甲基转移酶基因对于大肠杆菌来说是毒性基因。本研究中,我们尝试了许多宿主细胞,最终发现了能够表达来源于R.cellulolyticum的甲基转移酶的大肠杆菌HST08。II.R.papyrosolvens诱导型启动子的筛选及应用相对于R.cellulolyticum而言,R.papyrosolvens的进化程度更高,如其纤维小体中cip-cel基因簇的高度进化,暗示了其基因方面功能进化的更加完善。因此,探究该菌中的基因功能对于梭菌的生理研究具有重要的意义。但目前,该菌还缺乏一套完整的遗传体系,尤其是高效的诱导型启动子。首先,我们基于两种报告基因对两个外源梭菌诱导型启动子（来自C.acetobutylicum的阿拉伯糖诱导的启动子Para和C.perfringens的乳糖诱导的Plac）和两个内源诱导型启动子（纤维二糖诱导的Pcel和木聚糖诱导的Pxyl）在R.papyrosolvens中进行启动子活性分析。结果表明内源启动子Pxyl和外源启动子Plac在R.papyrosolvens中具有很好的特异性和严谨性。Pxyl的诱导时间较短,仅需诱导4 h,启动子活性就能达到最高水平;而Plac达到最高水平的诱导剂浓度较低,仅需要0.1 g/L。利用Pxyl和Plac,我们成功构建了基于Maz F的反向选择筛选系统,能够实现质粒在R.papyrosolvens中可控丢失,该系统为R.papyrosolvens通过诱导质粒丢失来筛选突变体提供一个非常好的工具。总而言之,本研究开发了一个R.cellulolyticum转化的质粒体内甲基化系统,实现了R.cellulolyticum低成本的快速转化,同时在R.papyrosolvens中通过筛选到的高特异性和严谨性的诱导型启动子,构建了基于Maz EF的反向筛选系统并实现了质粒在R.papyrosolvens中可控丢失。这些研究为这类纤维素降解梭菌的遗传改造提供了便利条件。