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兔疥螨病是家兔常见的多发性寄生虫病,具有高度接触性和传染性,能引起病兔发生剧痒及各种类型的皮炎,严重影响家兔的生长发育,降低皮毛质量,严重时可引起死亡,给养兔业造成巨大的经济损失。对该病病原的准确诊断是尽早对动物实施药物治疗、有效控制该病流行的关键。但长期以来,疥螨属内的螨虫虫种分类还是一个颇具争议的话题,疥螨的免疫机制也尚不清楚。目前,兔疥螨病防治仍以药物为主,尚无可用于免疫防制的疥螨疫苗。但药物长期使用不仅费用高,效果不理想,而且容易导致抗药虫株的出现和较严重的毒副作用,特别是药物在畜产品中的残留,通过食物链会对人体健康造成潜在威胁,有的甚至可能致癌。因此,本研究采用PCR技术扩增兔疥螨虫株的线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ(COI)基因,并进行测序和序列分析;同时克隆兔疥螨的副肌球蛋白基因(Pmy),构建该基因的原核表达载体和真核表达载体,对兔疥螨副肌球蛋白核酸疫苗、重组副肌球蛋白(PmyP)和疥螨全虫蛋白(ScTP)免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫应答进行分析,为解决兔疥螨虫株的分类地位和开发防治兔疥螨病的有效疫苗打下基础。主要研究工作和结果如下:1、采用PCR技术首次扩增了分离自中国兔和猪的4个疥螨分离株的线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ(COI)基因,并与GenBank中注册的14个国外疥螨分离株的同源基因进行了比较。序列分析结果显示:扩增的4个疥螨株COI基因长度均为1427 bp,序列间无插入、缺失,A+T含量(73%)明显高于G+C含量(27%),碱基组成存在明显偏移。兔和猪的4个疥螨分离株间的COI基因同源性较高(99.1%～100.0%),它们与澳大利亚人疥螨株、国外动物疥螨株的同源性范围为98.4%～99.6%。在构建的NJ树中,分离自中国兔和猪的4个疥螨分离株同澳大利亚人疥螨分离株、国外动物疥螨分离株亲缘关系较近。根据疥螨COI基因同源性分析和系统树构建结果,我们认为分离自中国猪和兔的4个疥螨分离株与澳大利亚人疥螨分离株以及国外的动物疥螨分离株均应属于同一个种。2、首次扩增出兔疥螨副肌球蛋白基因的全序列,测序并进行了生物信息学分析。结果表明:兔疥螨副肌球蛋白基因全长2628bp,序列中A+T含量(58.1%)和G+C含量(41.9%)差异不明显;与已报道猪疥螨虫株、红狐疥螨虫株、大熊猫足螨、黑白花奶牛德州足螨、刺翼尘螨、热带无爪螨的副肌球蛋白基因的同源性分别为99.6%、99.5%、83.0%、82.6%、82.1%和82.0%,推导的氨基酸同源性分别为100.0%、97.6%、97.6%、94.4%、97.1%和95.2%。兔疥螨副肌球蛋白基因共编码875个氨基酸,以Glu、Leu和Gln的含量最高,Cys、Pro和Trp的含量最低:副肌球蛋白分子理论值为102.36 kDa,理论pI=5.59,带负电荷,无信号肽,无跨膜区,含有大量的亲水性区域,共有4个潜在的N-糖基化位点;其二级结构中含96.91%的α-螺旋,0.11%的β-转角,2.86%不规则盘绕。3、将构建的原核表达质粒pET32a-Pmy转化表达宿主菌BL21(DE3)进行原核表达,同时对表达条件进行优化,确立了pET32a-Pmy表达的最佳条件为37℃、0.2 mmol/LIPTG诱导6 h,融合表达的副肌球蛋白分子量为124.36 kDa,并以不溶的包涵体形式存在于菌体中:免疫印迹发现该表达蛋白能与疥螨病患兔血清相识别。将构建的真核表达载体pVAX1-Pmy转染COS-7细胞,通过RT-PCR及间接免疫荧光检测,表明pVAX1-Pmy真核表达质粒在COS-7细胞中得到正常转录与表达。4、将构建的兔疥螨副肌球蛋白DNA疫苗pVAX1-Pmy以100μg/只剂量肌肉注射免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,每次间隔2周。一免后24 h、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、49 d、63 d、77 d及105 d采集小鼠的抗凝血、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉及脑组织,提取血液和各组织DNA进行PCR扩增。以纯化后的组织总DNA为模板,PCR法检测质粒DNA整合到小鼠细胞染色体基因组上的可能性,评价疫苗的安全性。结果表明:一免后24 h、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d及49 d能在小鼠血液及各检测的组织器官检测到该质粒;一免后63 d,除脑组织外,其余各组织器官及血液中均有质粒的分布:一免后77d,只在血液、肌肉和心脏中检测到质粒;一免后105 d仅在注射部位的肌肉中检测到该质粒。纯化后的组织基因组DNA经PCR扩增均呈阴性,未发现整合情况,证实该DNA疫苗安全性好。5、pMD18-T-IL-2、pMD18-T-IL-4、pMD18-T-IFN-γ质粒分别经BamHⅠ+XhoⅠ、EcoRⅠ+XhoⅠ、EcoRⅠ+HindⅢ酶切后,与经相同限制性内切酶处理的pVAX1质粒,经胶回收后,连接、转化入DH5α。扩大培养后小量抽提质粒,经PCR和双酶切鉴定正确,表明成功构建了pVAX1-IL-2、pVAX1-IL-4和pVAX1-IFN-γ真核表达质粒。6、将120只BALB/c小鼠随机分成对照组(PBS组、pVAX1组)、DNA疫苗免疫组(Pmy组、Pmy+IL-2组、Pmy+IL-4组、Pmy+IFN组)、蛋白疫苗免疫组[兔疥螨全虫蛋白组(ScTP组)和重组副肌球蛋白组(PmyP组)](共8组)。PBS组:肌肉注射PBS液100μL;pVAX1组:肌肉注射pVAX1质粒100μg;Pmy组:肌肉注射pVAX1-Pmy质粒100μg;Pmy+IL-2组:肌肉注射质粒pVAX1-Pmy和pVAX1-IL-2各100μg;Pmy+IL-4组:肌肉注射质粒pVAX1-Pmy和pVAX1-IL-4各100μg;Pmy+IFN组:肌肉注射质粒pVAX1-Pmy和pVAX1-IFN-γ各100μg;PmyP组:皮下注射重组副肌球蛋白50μg:ScTP组:皮下注射兔疥螨全虫蛋白50μg。共免疫3次,每次间隔2周,检测小鼠的抗体水平(IgG、IgG1、IgG2a、IgE、IgM)、淋巴细胞增殖能力、脾细胞悬液分泌的细胞因子(IL-2、IL-4、IL-5及IFN-γ)含量及外周血CD4~+、CD8~+T淋巴细胞亚群的数量。ELISA检测小鼠血清中的抗体结果显示:ScTP组和PmyP组小鼠的IgG、IgG1抗体水平高于DNA疫苗组,但这两个组小鼠的IgG2a水平低于DNA疫苗组;一免后14d～42d,Pmy+IL-2组、Pmy+IL-4组、Pmy+IFN组小鼠的IgG水平高于Pmy组;Pmy+IL-4组产生IgG1的水平高于Pmy组,除免疫后14 d,其余检测时间内均差异显著(P＜0.05);Pmy+IL-2组、Pmy+IFN组小鼠的IgG2a水平高于Pmy组,免疫后14 d～35 d,Pmy+IL-2组与Pmy组的差异显著(P＜0.05);Pmy+IL-4组产生的IgE水平高于其他免疫组,免疫后14 d,差异显著(P＜0.05);ScTP组和PmyP组产生的IgM水平高于各DNA疫苗组,免疫后7 d～35 d,与Pmy组差异显著(P＜0.05):免疫后21 d～42 d,Pmy+IL-2组小鼠的IgM值高于Pmy组、Pmy+IL-4组、Pmy+IFN组,但差异不显著(P＞0.05)。脾淋巴细胞增殖结果显示:ScTP组、PmyP组、Pmy组、Pmy+IL-2组、Pmy+IL-4组、Pmy+IFN组刺激指数明显高于pVAX1组刺激指数(P＜0.05),且DNA疫苗组的增殖能力大于蛋白疫苗组。脾细胞悬液分泌的细胞因子检测结果显示:Pmy+IL-2组、Pmy+IFN组小鼠脾细胞悬液分泌的IL-2含量显著高于其他免疫组(P＜0.05),它们分泌的IFN-γ显著高于Pmy+IL-4组、ScTP组及PmyP组(P＜0.05),但这两组的小鼠脾细胞悬液分泌的IL-4显著低于其他疫苗免疫组(P＜0.05);Pmy+IL-4组小鼠脾细胞悬液分泌的IL-4、IL-5显著高于其他疫苗免疫组(P＜0.05)。外周血CD4~+、CD8~+T淋巴细胞亚群数量检测结果显示:ScTP组、PmyP组、Pmy组、Pmy+IL-2组、Pmy+IL-4组、Pmy+IFN组小鼠外周血CD4~+、CD8~+T数量明显高于空载体组(P＜0.05)。从检测分析结果来看,疥螨全虫蛋白和重组副肌球蛋白免疫小鼠主要引起小鼠的Th2免疫应答;而pVAX1-Pmy+pVAX1-IL-2和pVAX1-Pmy+pVAX1-IFN-γ免疫小鼠后主要引起小鼠的Th1型免疫应答:pVAX1-Pmy+pVAX1-IL-4则主要引起小鼠的Th2型免疫应答;且疫苗免疫各组小鼠的T淋巴细胞均进行了有效增殖。本研究对兔疥螨全虫疫苗、兔疥螨重组副肌球蛋白疫苗及副肌球蛋白核酸疫苗的免疫应答进行了评价,为研制高效的兔疥螨疫苗奠定了基础。