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以半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)为研究对象,运用cDNA末端快速克隆技术、组织学切片、荧光实时定量(qRT-PCR)、RNA原位杂交、免疫组织化学、细胞培养技术、显微注射技术、Western-blotting等方法;获得了孕酮受体膜组分1(Progesterone receptor membrane component1,PGRMC1)的cDNA全长序列,对PGRMC1在性成熟雌鱼的组织表达及分布和在繁殖周期脑、垂体、卵巢中的表达特征进行了分析;对PGRMC1在不同发育时相的卵母细胞的表达特征进行了定量和定性研究;添加外源激素处理下,分析体外培养不同发育时相的卵母细胞中PGRMC1基因和蛋白的表达特征;对PGRMC1敲降与卵母细胞成熟关系进行分析;通过上述研究为探讨PGRMC1在半滑舌鳎生殖功能奠定基础,同时为提高鲆鲽类的人工繁殖技术提供了理论依据。研究结果如下:1.PGRMC1基因的克隆及组织和周期表达特征采用RACE方法,从半滑舌鳎卵巢中克隆了PGRMC1全长cDNA。半滑舌鳎PGRMC1基因全长为1335bp,其开放阅读框为546bp,编码了含181个氨基酸的蛋白;将推断的氨基酸序列与其他物种PGRMC1氨基酸序列进行多重比较分析,发现半滑舌鳎PGRMC1具有1个跨膜区域,在二级结构上与其他物种的PGRMC1具有很高的保守性;氨基酸序列与青鳉(Oryzias latipes)同源性最高达到82.9%;与青斑河鲀(Tetraodon nigroviridis)同源性为81.2%;系统进化分析显示半滑舌鳎PGRMC1与其他鳉形目和鲀形目鱼类聚为一个分支。qRT-PCR结果表明,PGRMC1 mRNA组织表达具有广泛性,但表达量存在差异,在卵巢组织中相对表达量最高(P<0.05);半滑舌鳎垂体、脑和卵巢中PGRMC1 mRNA表达水平在不同卵巢发育时期的变化特性显示,卵巢中PGRMC1 mRNA表达水平在卵巢发育各个阶段都有较高表达水平(P<0.05),垂体和脑中PGRMC1 mRNA在II到V期表达水平明显低于卵巢(P<0.05);并且卵巢PGRMC1 mRNA表达水平在产卵期(V期)达峰值。2.半滑舌鳎PGRMC1在不同组织中基因和蛋白定位分析分析半滑舌鳎PGRMC1蛋白序列选择抗原表位,并合成相应的免疫多肽;将合成的多肽常规免疫新西兰大白兔,制备抗体。使用多克隆抗体进行Western-blotting检测蛋白的表达水平,多克隆抗体用合成的多肽封闭检测特异性。通过Western-blotting技术分析半滑舌鳎不同组织中PGRMC1的蛋白表达量情况。通过RNA原位杂交、免疫组化等方法分析舌鳎不同组织切片中PGRMC1mRNA和蛋白的分布情况。免疫印迹结果显示:PGRMC1蛋白在性腺、脑中表达量较高,在肾、头肾、垂体组织中也有表达,但表达量相对较低;说明PGRMC1主要在性腺、脑组织中发挥作用。RNA原位杂交结果显示:在卵巢成熟期中,PGRMC1 mRNA的阳性信号在卵母细胞的膜上分布明显,即PGRMC1在卵母细胞膜上显著性表达,进一步证明PGRMC1可能在膜/细胞质和细胞核内参与重要的细胞过程。在舌鳎肝脏、肾脏、头肾、脑、垂体也都检测到PGRMC1阳性信号,分布于组织的不同部位。PGRMC1在肝脏主要定位在胆小管和肝静脉等与外界联系的管腔周围,在肾脏中观察到其在肾小管附近表达丰富。从形态学上解析PGRMC1在不同组织中的表达特点,表明其在不同组织中能够介导孕激素行使不同生理作用。3.半滑舌鳎PGRMC1在不同发育时相卵母细胞中的表达量变化通过qRT-PCR和Western-blotting技术研究了性成熟半滑舌鳎PGRMC1mRNA在卵巢发育IV期和V期不同发育时相卵母细胞的表达,以及不同浓度HCG处理对卵巢发育V期鱼不同发育时相卵母细胞PGRMC1基因和蛋白的表达影响。结果显示:在不同发育期卵巢中,PGRMC1 mRNA的表达最高值出现在半滑舌鳎卵母细胞的不同发育时相,但整体趋势大体一致。在卵巢发育IV期,处于IV时相的卵母细胞PGRMC1 mRNA表达量最高(P<0.05)。在卵巢发育V期,处于V时相卵母细胞PGRMC1 mRNA表达量最高(P<0.05)。卵母细胞PGRMC1 mRNA表达的最高值出现在性腺发育V期,舌鳎的V时相卵母细胞,表明PGRMC1主要在成熟阶段发挥作用。采用不同浓度HCG处理卵巢发育V期舌鳎不同时相的卵母细胞,并对其表达量进行检测。结果显示:20IU/ml HCG对PGRMC1 mRNA和蛋白表达的调控作用比10IU/ml HCG作用更明显,表明PGRMC1 mRNA和蛋白表达对HCG调控作用存在剂量依存关系。并且HCG对舌鳎不同时相的卵母细胞的促成熟作用效果不同,在V时相促进作用最明显(P<0.05),表明PGRMC1主要在成熟阶段发挥作用。HCG激素调控作用下,PGRMC1的正向应答效应预示其参与了卵母细胞成熟调控。4.半滑舌鳎PGRMC1敲降研究基因敲降技术是研究基因功能的一种重要的实验手段。本研究以体外培养的半滑舌鳎卵母细胞为实验材料,设计合成PGRMC1-Morpholino抑制半滑舌鳎PGRMC1基因的功能,同时设置对照组、注水组、反义组、反义对照组四个平行组,显微注射,然后运用qRT-PCR方法和Western-blotting方法检测显微注射后卵母细胞PGRMC1 mRNA和蛋白表达特征,研究PGRMC1表达下调对半滑舌鳎卵母细胞成熟过程的影响,为进一步探讨PGRMC1在半滑舌鳎繁殖过程的功能提供基础资料。